李虹竹，許能貴，易 瑋，趙家瑩*

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種進展性、退行性神經疾病，易發(fā)于65歲以上老年人，以細胞間淀粉樣斑塊及神經纖維纏結為主要特征，起病隱匿，進展緩慢，最終導致癡呆[1]。AD是21世紀公共衛(wèi)生保健的巨大挑戰(zhàn)之一，截至2015年，全球大約有4 700萬患者，僅中國就有600萬人[2]，而這個數(shù)字將每20年翻一倍，目前沒有一種有效藥物能治愈或者逆轉阿爾茨海默病。越來越多的天然產物通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認證上市，中藥作為天然產物的重要組成部分，以其在治療AD中的獨特優(yōu)勢，發(fā)揮了非常重要的作用，所以探究中藥治療阿爾茨海默病的機制有一定的價值。

山藥是薯蕷科多年生纏繞性藤本薯蕷的根莖[3]，性平味甘，屬脾、肺、腎經，《神農本草經》記載“主傷中，補虛贏，除寒熱邪氣，補中益氣力”。腎虛髓空是AD發(fā)生的根本原因，腎主水，腎虛勢必影響水液代謝，水液停聚則痰飲水濕內生，從而損傷脾胃，運化失司，反過來影響腎精生成，惡性循環(huán)，導致癡呆。補腎健脾是治療阿爾茨海默病的基本治則之一，而山藥是治療AD常用方劑的重要藥物組成部分，有報道，山藥的組方使用頻率位列第5[4]。研究表明，山藥中的活性成分具有抗炎、抗氧化、增強腦組織內ATP酶活性以及改善精神狀況的作用[5-7]。鑒于目前對于山藥治療阿爾茨海默病的作用機制仍不明確，因此對山藥的有效成分、分子機制進行探尋，有利于山藥的開發(fā)利用，也為從補腎健脾角度治療阿爾茨海默病提供理論依據(jù)。

“網(wǎng)絡藥理學”的概念在2007年被首次提出[8]，認為藥物療效是多靶點、多成分、多途徑作用的結果，這與中藥的作用特點不謀而合。本文利用網(wǎng)絡藥理學分析藥物-疾病-靶點相互作用關系，從生物網(wǎng)絡穩(wěn)態(tài)的角度探討山藥與阿爾茨海默病的療效規(guī)律及現(xiàn)代藥理學機制。

1 材料與方法

1.1 山藥活性成分及潛在靶點 通過中藥藥理學系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索山藥已知的化學成分，根據(jù)口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選，并對山藥的有效成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫進行作用蛋白靶點預測提取。

1.2 靶點名稱標準化 將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的蛋白靶點名導入蛋白質數(shù)據(jù)庫(UniProt Database)，物種設置為人類(Human)，將作用人類蛋白名稱轉換成標準的基因名。

1.3 AD疾病相關靶點獲取 通過人類基因卡片數(shù)據(jù)庫(GeneCards)及人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，在線檢索輸入“Alzheimer′ disease”，搜索與阿爾茨海默病相關的基因，將得到的疾病基因靶點進行篩選，剔除重復的靶點，設置關聯(lián)分數(shù)(Relevance score)≥10，結果導出為Excel文件。

1.4 治療AD活性成分篩選 將人類靶點的基因名與疾病相關基因名進行對比匹配處理，共同靶標結果就是山藥治療AD的關鍵靶點基因，反向篩選出治療AD的潛在活性成分，并使用R軟件(Version R x64 3.6.2)繪制維恩圖。

1.5 AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡構建 將山藥活性成分、基因靶點導入Cytoscope3.6.1，構建疾病-藥物-活性成分-靶點基因可視化網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中節(jié)點(node)代表疾病、藥物、靶點基因、活性成分；邊(edge)用來連接疾病與基因、基因與活性成分、活性成分與藥物的關系。

1.6 蛋白靶點互作(Protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡建立 將山藥治療AD的關鍵靶點基因輸入蛋白互作網(wǎng)絡(STRING數(shù)據(jù)庫)，設置物種為人類(Homo sapiens)進行構建，設置可信度為中等可信(Medium confidence)，隱藏未連接的節(jié)點，其他參數(shù)數(shù)據(jù)庫保持系統(tǒng)推薦設置，進行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關系網(wǎng)絡。

1.7 靶點通路分析 在GO生物過程與KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析及通路建立，將關鍵靶點基因輸入到用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，DAVID)，選擇物種為人類(Homo sapiens)進行GO生物過程分析和KEGG信號通路富集，以P<0.05進行靶基因篩選，分析山藥發(fā)揮藥理作用的生物過程及主要信號通路；在R軟件(Version R x64 3.6.2)中使用Bioconductor-pathview建立通路圖。

1.8 Autodock vina分子對接驗證網(wǎng)絡藥理學 我們從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載化合物結構，并在OpenBabel 2.4.1的MMFF94力場下對化合物的結構進行優(yōu)化。AD相關靶點蛋白的三維結構從PDB(Protein Data Bank)獲得。使用AutodockTools1.5.6 對化合物進行可旋轉鍵的搜尋與定義，對蛋白結構進行除去水分子、添加氫原子、添加電荷，并保存為PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2進行分子對接研究來驗證網(wǎng)絡藥理學的篩選結果。根據(jù)配體的位置，確定了活性位點的坐標，為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness設置為20，其他參數(shù)均采用默認值。選取對接結合能量最低的構象用于對接結合模式分析，并使用Discovery Studio Visualizer進行作圖。

2 結果

2.1 山藥的活性成分及靶點 依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標準，篩選出山藥的主要化學成分有16種，其中4種活性成分denudatin B、hancinol、doradexanthin、methylcimicifugoside_qt未找到靶標蛋白，見表1。去除重復，共預測到潛在靶點144個，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標準基因名轉換后，共得到109個作用人類的基因靶點。通過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫共檢索到與AD相關基因8 730個，將AD相關的靶點按相關性分數(shù)取前802個，后面分數(shù)較小無參考意義，將2種方法得到的靶點取交集即得到AD相關靶點，與山藥有效成分靶點相匹配映射得到山藥治療AD靶點共24個，見圖1。

圖1 山藥靶點與AD靶點匹配Venn圖

2.2 AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡構建 將山藥活性成分、靶點基因、疾病導入Cytoscape軟件，構建AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡可視化網(wǎng)絡，見圖2，包含12個化學成分，53個靶點。節(jié)點(node)表示山藥活性成分、靶蛋白或 AD。邊(edge)代表這些分子之間的互作關系，即某個成分與靶點存在聯(lián)系。其中stigmasterol與20個靶點相連接，可能是山藥治療AD最重要成分，piperlonguminine、kadsurenone、hancinone C、isofucosterol、diosgenin和AIDS180907均與7個及以上靶點連接，見表2和表3。

2.3 PPI及Hub蛋白確定 將AD相關靶點基因導入string在線數(shù)據(jù)庫，設置隱藏未連接的靶點，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡，見圖3。包含節(jié)點53個，邊233條，連接度值平均為8.79。利用Cytoscape插件中Degree算法確定度值前6為Hub蛋白，其中AKT1、PTGS2、VEGFA等25個蛋白度值均大于平均值，見表4。

圖2 “山藥-活性成分-靶點基因-AD”網(wǎng)絡

表2 山藥治療AD的活性成分及潛在作用靶點

表3 重要化合物名稱及化學結構式

圖3 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡

表4 蛋白互作網(wǎng)絡拓撲結構分析結果

2.4 GO-BP分析 如圖4所示，山藥治療阿爾茨海默病核心基因的GO功能主要集中在G protein-coupled amine receptor activity(G蛋白偶聯(lián)氨受體活性，9個基因)、steroid hormone(甾類激素，8個基因)、nuclear receptor activity(核受體的活性，7個基因)、transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding(轉錄因子的活性，直接配體調控序列特異性DNA結合，7個基因)、neurotransmitter receptor activity(神經遞質受體活性，7個基因)、G protein-coupled neurotransmitter receptor activity(G蛋白偶聯(lián)神經遞質受體活性，6個基因)、steroid binding(甾類激素結合，6個基因)。

2.5 KEGG通路建立及分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG分析，共獲得71條富集結果，限定P<0.05，前20條 KEGG 代謝通路及其相關信息見圖5。包括神經活性配體受體交互通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection pathway)、乳腺癌通路(Breast cancer pathway)、前列腺癌(Prostate cancer pathway)、低氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)。其中AKT1、MTOR、GSK3β參與卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、乳腺癌信號通路的調節(jié)。

2.6 分子對接驗證 山藥的有效化學成分配體與阿爾茨海默病蛋白受體的對接結果見表5，分子對接過程及結合位點見圖6、圖7，親和力(Affinity score)代表分子對接吻合度，絕對值的分數(shù)越高代表配體與受體蛋白結合性越好。分子對接結果表明，山藥的活性成分與AKT1、MTOR、GSK3β蛋白分子對接吻合度較好，富集分析中卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路及乳腺癌通路也顯示山藥作用的靶點在AKT1、MTOR、GSK3β因子，該結果說明分子對接結果與網(wǎng)絡藥理學篩選結果一致，用分子對接的方式驗證了網(wǎng)絡藥理學的可靠性。

表5 配體-受體分子對接結果

圖4 GO分析山藥治療AD生物過程圖

圖5 山藥治療AD的作用通路圖

圖6 分子對接結果

圖7 分子對接位點示意圖

3 討論

通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、MTOR、GSK3β可能是山藥有效成分治療AD的核心靶點，AKT又稱蛋白激酶B，是PI3K信號通路調節(jié)細胞生長、遷移功能的主要下游信號分子，AKT1的基因多態(tài)性可能與AD相關[9]，AKT基因位點rs2498786突變可能增加阿爾茨海默病的發(fā)病率，治療上采用促進Akt1/mTOR信號通路的方式可能是治療AD新的靶點[10]。GSK3β與PI3K/Akt信號通路有關，研究發(fā)現(xiàn)，sAPPα刺激 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，但是β淀粉樣蛋白低聚體會阻斷這個信號轉導通路，從而導致特殊部位神經元的易損傷性增加，說明PI3K/Akt信號通路可能參與淀粉樣蛋白的代謝過程[11]。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)，蛇床子素通過激活 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，降低AD模型小鼠腦內磷酸化的Tau蛋白，發(fā)揮抗AD的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能與20個靶點相連接，是山藥治療AD的主要有效成分，可通過減少氧化應激和自噬失活，對缺血再灌注損傷發(fā)揮神經保護作用[13]。結合分子對接結果，預測豆甾醇可能是通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制Tau蛋白的過度磷酸化來治療AD。其次，蓽茇寧酰胺也是山藥的主要活性成分，Gu等[14]發(fā)現(xiàn)，蓽茇寧酰胺通過抑制NF-κB信號通路減少由于脂多糖誘導產生的淀粉樣沉積和神經炎癥，而PTGS2可以激活NF-κB信號通路[15]，與AD的發(fā)病密切相關[16-17]。PTGS2還參與環(huán)氧化酶(COX-2)的編碼，AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)多個腦區(qū)環(huán)氧化酶的過表達[18]，通過干預PTGS2基因能降低環(huán)氧化酶的含量，從而改善神經炎癥。蓽茇寧酰胺與PTGS2對接，預測其可能通過PTGS2抑制NF-κB信號通路來治療AD。

GO及KEGG分析結果顯示，山藥治療AD的機制主要是通過神經活性配體受體交互通路，降低乙酰膽堿酯酶活性或作用于CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM5膽堿能受體。“膽堿能學說”認為中樞神經系統(tǒng)的膽堿能系統(tǒng)神經元功能損害會導致AD患者認知功能障礙[19]，CHRM是膽堿能毒蕈堿受體，這類受體與海馬的學習、記憶功能密切相關[20]，而Aβ的沉積可損害M受體與G蛋白的偶聯(lián)，阻斷M受體激動后的信號傳導[21]，結合GO-BP的結果，山藥有效成分的功能與G蛋白偶聯(lián)受體活性密切相關，因此，山藥的活性成分治療AD可能是通過恢復M受體與G蛋白的偶聯(lián)及信號傳導，影響中樞膽堿能神經系統(tǒng)的功能來發(fā)揮療效。除了興奮性神經元，動物實驗及臨床試驗均發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神經元有關[22-23]，Yadav 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能增加GABA水平，減少多巴胺、丙二醛、TNF-α水平，降低乙酰膽堿酯酶活性，所以在神經活性配體受體交互通路中山藥還可能是作用在GABA神經遞質上來發(fā)揮治療的作用。鈣穩(wěn)態(tài)的失衡會導致AD的發(fā)生，鈣離子可調控細胞的增殖、分化、轉錄和凋亡，鈣信號通路與記憶的形成、能量的產生及許多蛋白的結合密切相關[25]。在鈣離子通路中，山藥的有效成分作用于G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，GPCR產生第二信使，從而調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，減少Aβ的產生。在卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路及乳腺癌通路中，山藥作用于Akt、mTOR、NF-κB、HIF1α、GSK-3因子。mTOR是自噬主要的負性調節(jié)因子，自噬能降解和清除機體異常沉積的蛋白包括Aβ蛋白[26]。山藥可能通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活，降低mTOR的活性，恢復細胞的自噬水平，促進對Aβ沉積的清除來發(fā)揮治療作用，同時PI3K/Akt信號通路、NF-κB通路、Wnt-GSK3β通路還與消化系統(tǒng)相關[27]，可以調節(jié)胃黏膜細胞增殖與分化，這可能是山藥健脾通過補氣作用治療阿爾茨海默病的重要依據(jù)。

4 結論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學對山藥治療阿爾茨海默病的活性成分及作用機制進行了分析，并且通過Autodock vina分子對接軟件驗證了山藥的有效成分與重要靶點有較好的吻合度，驗證了預測靶點的可靠性。建立疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖發(fā)現(xiàn)，山藥中的有效成分stigmasterol、diosgenin、piperlonguminine可能通過降低乙酰膽堿酯酶活性，抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路降低淀粉樣沉積治療AD，具有多成分、多靶點、多通路的特點，為山藥治療AD的潛在機制提供了新的角度，也為進一步驗證其藥理作用機制提供了理論基礎。