胡錦洋，?？〗?，蔣士生

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 410006）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸病的一種，常表現(xiàn)為便血、腹痛腹瀉、消瘦等癥狀，易反復(fù)發(fā)病且難以治愈，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制不明，但考慮多與遺傳、環(huán)境、免疫、腸道菌群失調(diào)等有關(guān)，其中腸黏膜屏障被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎病理進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)[2]。芪連結(jié)腸寧具有顯著的促進(jìn)潰瘍恢復(fù)和健脾止瀉的功效[3]。此次研究旨在通過檢測腸黏膜保護(hù)因子黏蛋白2（MUC2）、腸三葉因子（TFF3）以及TLR4/NF-κB炎癥信號通路相關(guān)指標(biāo)，探討芪連結(jié)腸寧對腸黏膜屏障及腸道炎癥因子的影響，為芪連結(jié)腸寧治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性2 月齡SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（160±15）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK（湘）2020-0008；飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物倫理審查號：2021-0088；12 h/ 12 h 明暗交替，室溫（25±3）℃，相對濕度65%，噪音≤60 dB，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始造模。芪連結(jié)腸寧組成：黃芪15 g，黨參15 g，炒白術(shù)15 g，茯苓15 g，陳皮10 g，黃連10 g，炮干姜6 g，蒲黃10 g，蒲公英15 g，敗醬草15 g，椿根皮10 g，木香10 g，白芍15 g，甘草5 g。藥物浸泡于蒸餾水中40 min，第一煎大火煮沸后，小火煎煮30 min；第二煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，最后將2 次煎煮湯藥混合濃縮制成含生藥2.48 g/mL 的藥液。所有中藥材均購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，4 ℃保存，使用前預(yù)熱。葡聚糖硫酸鈉（上海翊圣生物公司，批號D2021571）；Trizol（美國Thermo 公 司，批號10296010）；HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR、qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊公司，批號QV114-01、QV318-12）；兔IgG-免疫組化試劑盒、HRP-羊抗兔IgG、Anti-GAPDH Antibody、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物公司，批號15H1L16F0334、BST15H06A15H65、BST14H06A18G11、BST16H18B51）；Anti-NF-κB p65 Antibody、Anti-TLR4 Antibody、Anti-IL-6 antibody、Anti-TNF alpha antibody、Anti-MUC2 antibody（英國Abcam 公司，批號ab 22048、ab 32536、ab 233706、ab 215188、ab 272692）；伊紅染液、蘇木素染液（Servicebio 公司，批號：ZH201285、ZH209148）。

Nanodrop 超微分光光度儀（美國Thermo，型號：Nanodrop 200）；實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad，型號：CFX 96）；石蠟切片機(jī)（德國徠卡，型號：RM 2235）；BX 43 光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，型號：IX 73-U）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司，型號：SpectraMax 5）；高速冷凍離心機(jī)（日本日立，型號：CR22G Ⅱ）；凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂，Gel Doc XR+）。

1.2 動物分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、芪連結(jié)腸寧低劑量組、芪連結(jié)腸寧中劑量組及芪連結(jié)腸寧高劑量組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)研究[4]，采用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）喂養(yǎng)建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。除正常組外，用蒸餾水配制濃度為5%的葡聚糖硫酸鈉溶液，放入飲水瓶中自由飲用，連續(xù)用藥7 d。造模第7 天隨機(jī)選取2只大鼠處死，通過觀察大鼠體質(zhì)量、大便性狀、出血情況進(jìn)行DAI評分，以及結(jié)腸黏膜損傷程度、結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)檢查評價UC 大鼠模型建模成功。計(jì)算公式：DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。

表1 DAI評分量表

1.3 干預(yù)方法及DAI測定 造模結(jié)束后第2 天起開始灌胃給藥。根據(jù)人臨床用量的等效劑量和動物體表面積計(jì)算[5]，芪連結(jié)腸寧低、中、高劑量組分別給予含生藥為1.24、2.48、4.96 g/Kg 的中藥灌胃，空白組、模型對照組均以蒸餾水灌胃。以上各組均每日2 次，連續(xù)3 周。分別于給藥前及給藥后每周末觀察大鼠體質(zhì)量變化，進(jìn)食、活動及糞便情況，根據(jù)體質(zhì)量下降、糞便性狀和隱血情況，計(jì)算DAI。

1.4 HE 染色觀察結(jié)腸組織形態(tài) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉，立即暴露腹腔及胸腔，以生理鹽水行心臟灌注，快速取結(jié)腸組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅染色，鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。另一部分結(jié)腸組織液氮速凍，然后-80 ℃保存用于后續(xù)檢測。

1.5 免疫組化法觀察結(jié)腸組織MUC2 表達(dá)情況 取部分結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟水化。3%H2O2封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)后，5%BSA 封閉30 min。一抗4 ℃（1:200）孵育過夜，二抗室溫（1:200）孵育30 min，DBA 顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果通過Image-Pro Plus 6.0 對MUC2 的平均光密度（IOD 值）進(jìn)行半定量分析。

1.6 Western blot檢測結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65、MUC2、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平 取適量結(jié)腸組織冰上勻漿，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，收集上清凍存-80 ℃?zhèn)溆?。BCA 法對蛋白定量。適量蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，5%濃縮膠60 V，10%分離膠90 V；然后濕轉(zhuǎn)90 min，電流300 mA，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗，4 ℃搖床過夜。次日，TBST 漂洗3 次，二抗（1:10 000）室溫孵育90 min，TBST 漂洗3 次，添加ECL 發(fā)光液暗室曝片。用ImageJ v1.8.0軟件分析各條帶灰度值，進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)各組與β-actin 灰度值的比值。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)腸組織MUC2、TFF3 mRNA 的表達(dá) 采用TRIZOL 試劑提取結(jié)腸組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA 的質(zhì)量和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成c DNA；然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72℃延伸30 s；40個循環(huán)，溶解曲線 60～95 ℃測溶解曲線，得出內(nèi)參及各指標(biāo)Ct值。引物由南京諾唯贊生物科技有限公司合成，引物序列如下表2。根據(jù)相對定量法2-ΔΔCt計(jì)算出mRNA 的相對表達(dá)量。

表2 RT-qPCR 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用ANOVA 方差分析，用LSD 法（方差齊）或Dunnett's T3（方差不齊）作組間多重比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化及給藥前后DAI評分比較 見表3、表4。與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠體質(zhì)量均有不同程度增加（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠在給藥第7、14、21 天時DAI評分均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01）；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，低劑量組大鼠在給藥第21 天時DAI評分增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較（，n =10）g

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較（，n =10）g

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，▲P ＜0.05

表4 各組大鼠疾病指數(shù)活動評分（DAI）比較（，n =10）

表4 各組大鼠疾病指數(shù)活動評分（DAI）比較（，n =10）

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，▲P ＜0.05

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠腸道黏膜上皮完整，存在大量正常的杯狀細(xì)胞，隱窩形態(tài)正常，腺體排列整齊規(guī)則，各層結(jié)構(gòu)未見異常，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組黏膜上皮細(xì)胞脫落壞死，大量杯狀細(xì)胞丟失，黏膜層及黏膜肌層有大量炎性細(xì)胞浸潤。芪連結(jié)腸寧低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜病變均較模型組有不同程度的減輕，存在較多的杯狀細(xì)胞和隱窩，腺體排列尚規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤也相對減少，且中、高劑量組較為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理改變情況（HE，n =10，×200）

2.3 各組大鼠結(jié)腸MUC2蛋白表達(dá)觀察 如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達(dá)減少（P＜0.01）；與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達(dá)均不同程度增加（P＜0.01）；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，低劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。

圖2 A1-A5 為各組大鼠結(jié)腸MUC2 蛋白表達(dá)情況（免疫組化，×200）；B 為各組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白平均積分光密度值比較（，n =10）

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3蛋白表達(dá)水平比較 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠結(jié)腸組織TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)均有不同程度的下降（P＜0.05，P＜0.01），MUC2、TFF3 蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，低劑量組大鼠結(jié)腸組織TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01），MUC2、TFF3蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖3 A 為各組大鼠結(jié)腸組織蛋白電泳條帶圖（Western blot）；B1～B7 為各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3 蛋白相對表達(dá)量比較（，n =10）

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織MUC2、TFF3 mRNA 表達(dá)情況比較 見表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜MUC2、TFF3m RNA 的表達(dá)情況（，n =5）2-△△Ct

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜MUC2、TFF3m RNA 的表達(dá)情況（，n =5）2-△△Ct

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P ＜0.05

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)可歸于中醫(yī)的“泄瀉”“久痢”“腸風(fēng)”等病，發(fā)病主要以素體脾胃虛弱為基礎(chǔ)，兼之感受外邪或飲食、情志失調(diào)等誘因，導(dǎo)致濕、熱、瘀、毒、痰等郁結(jié)腸道，氣血凝滯，腸絡(luò)損傷，壅為膿血，遂發(fā)病[6]。本課題組蔣士生教授認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎的治療關(guān)鍵應(yīng)從脾胃入手，以“脾胃虛弱，濕熱蘊(yùn)腸”為病機(jī)特點(diǎn)，提出活動期“標(biāo)本同治”，緩解期“扶正固本”的學(xué)術(shù)思想[7-8]；芪連結(jié)腸寧方中黃芪補(bǔ)中益氣，黃連清泄中焦?jié)駸?，二藥攻補(bǔ)兼施，相須為用，同為君藥；人參、白術(shù)、陳皮補(bǔ)氣健脾祛濕，黃連、干姜辛開苦降、寒溫并用，蒲黃、蒲公英、敗醬草、椿根皮清熱活血、澀腸祛瘀，木香調(diào)理腸道氣機(jī)，白芍酸甘斂陰止痛，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)脾健胃祛濕、活血拔腐生新、收斂固澀止瀉之功效[9-11]。本次研究結(jié)果顯示，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠在給藥后體質(zhì)量均增加，DAI評分逐漸降低，結(jié)腸組織病理損傷均有不同程度的恢復(fù)。

MUC2 是由杯狀細(xì)胞分泌的一種形成黏液凝膠的分泌型寡聚體黏蛋白，在腸黏膜修復(fù)重建及腸黏膜免疫屏障中具有重要作用[12]。腸道黏液層是抵御致病微生物或其他毒素的重要機(jī)械屏障，當(dāng)外源或內(nèi)源性刺激物及致病菌入侵時，腸道黏膜上的杯狀細(xì)胞Toll 樣受體（TLRs）受到刺激并激活相應(yīng)下游信號傳導(dǎo)通路，聚集周圍杯狀細(xì)胞大量分泌黏液以隔絕致病因子，保護(hù)腸黏膜上皮細(xì)胞[13]。本研究中，模型組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達(dá)明顯降低，可能與杯狀細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致其無法分泌MUC2 有關(guān)，而芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達(dá)均不同程度升高，提示芪連結(jié)腸寧能在一定程度上恢復(fù)杯狀細(xì)胞分泌MUC2 蛋白的功能，從而對潰瘍性結(jié)腸炎起到治療作用。TFF3 主要是由黏膜細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腺細(xì)胞合成分泌進(jìn)入腸道，眾多研究表明其主要與黏蛋白相互作用，調(diào)控黏液層的酸滲透及增加黏液的黏度從而發(fā)揮保護(hù)腸黏膜的生理功能[14]。TFF3 還可通過刺激血管表皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，修復(fù)腸上皮[15]。本研究中，芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠結(jié)腸組織TFF3蛋白表達(dá)及TFF3 mRNA 表達(dá)均明顯增加[16]。

潰瘍性結(jié)腸炎作為一種原因不明的腸道慢性炎癥性疾病，與機(jī)體免疫功能紊亂密不可分[17-18]。TLR4是TLRs 家族的重要一員，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路是潰瘍性結(jié)腸炎病理進(jìn)展的重要一環(huán)[19]。當(dāng)TLRs 與革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）相結(jié)合識別后促使I-κB 發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB 被激活，啟動和調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，加劇腸道炎癥反應(yīng)；釋放的炎癥因子又可逆向激活NF-κB，形成正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步加重炎癥狀態(tài)[20]。本研究中，模型組大鼠結(jié)腸組織TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)明顯增加，而芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠均不同程度降低，表明芪連結(jié)腸寧能有效調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 炎癥信號通路發(fā)揮對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

綜上，芪連結(jié)腸寧能有效改善潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織的病理損傷，降低DAI評分，降低結(jié)腸組織TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)，增加MUC2 及TFF3 表達(dá)，從而達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的；其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞黏液分泌，增強(qiáng)腸黏膜屏障的保護(hù)功能，進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化有關(guān)。其中芪連結(jié)腸寧中、高劑量組療效及調(diào)節(jié)作用較為顯著。