席雅婧，康天倫，錢(qián)唐亮，侯秀娟，朱躍蘭*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科，北京 100078）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以累及關(guān)節(jié)滑膜為主的系統(tǒng)性自身免性疾病。間質(zhì)性肺?。╥nterstitial lung disease，ILD）是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺?。╮heumatoid arthritis associated with interstitial lung disease，RA-ILD）在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的發(fā)病率為10%～50%[1-2]，病死率為10%～20%，平均生存期為5～8 年[3-4]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。芍甘附子湯加味是課題組在經(jīng)典方劑芍藥甘草附子湯的基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，在臨床[5]及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]中均驗(yàn)證了其有效性。本研究擬探討芍甘附子湯加味對(duì)KL-6、IL-6 等致纖維化細(xì)胞因子的影響及作用，為芍甘附子湯加味緩解類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的發(fā)生發(fā)展提供一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠60 只，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量100～110 g，由北京華阜康動(dòng)物有限技術(shù)公司提供，清潔動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。加味芍甘附子湯藥物組成：白芍、生甘草、制附片、青風(fēng)藤、雞血藤，藥材購(gòu)買(mǎi)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，并由制劑室代煎，并將以藥液水浴蒸發(fā)方法濃縮，使?jié)饪s后的藥液濃度按小、中、大劑量分別為0.443、0.885 g/mL 和1.770 g/mL。后將藥液于4 ℃冰箱保存。雷公藤多苷片每片10 mg，源自湖南千金協(xié)力藥業(yè)，用蒸餾水將其配制成濃度為0.625 mg/mL 的藥物混懸液。包埋機(jī)器（武漢俊杰公司），脫水機(jī)（武漢俊杰公司），病理切片機(jī)（上海徠卡公司），組織攤片機(jī)（浙江科迪公司），烤箱（上海慧泰公司），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），成像系統(tǒng)（日本尼康公司），全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司）。牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，貨號(hào)20022），不完全弗氏佐劑（Sigma 公司，貨號(hào)7002），戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司），蘇木素-伊紅染液（武漢皮諾飛公司，貨號(hào)PN0004），大鼠IL-6、IL-17 ELISA 試劑盒（multisceience 公司，貨號(hào)分別為70-EK306/3-96、70-EK317/3-96），大鼠KL-6 ELISA 試劑盒（BG 公司，貨號(hào)BG20201108Ra）。

2 方法

2.1 造模與分組 將60 只SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白組10 只，造模組50 只?？瞻捉M予以正常飲食喂養(yǎng)，直至試驗(yàn)結(jié)束。造模組依據(jù)徐淑云《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型鼠，成功率約為80%。具體制備方法為：將牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑（IFA）混合，制備成濃度為2 mg/mL 的混合物，使用高速分散器混勻，最終形成滴入水中而不散的“油包水”狀，隨后在大鼠左足和尾根部分別多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 mL，同時(shí)按壓注射部位使其充分吸收。1 周后取0.1 mL 于大鼠尾根部加強(qiáng)免疫1 次。第2 周末將造模成功的40 只大鼠隨機(jī)分為5 組，每組8只，分別為對(duì)照組、大、中、小劑量中藥組及雷公藤組。空白組與對(duì)照組蒸餾水灌胃，其余4 組分別給予相對(duì)應(yīng)的藥物進(jìn)行灌胃，大劑量組17.70 g/（kg·d），中劑量組8.85 g/（kg·d），小劑量組4.43 g/（kg·d），雷公藤組6.250 mg/（kg·d）。連續(xù)灌胃4 周。所有大鼠在第6 周末處死，用2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心后收集血清-80 ℃保存。將取完血后的大鼠沿腹部正中線(xiàn)剪開(kāi)充分暴露胸腔，鈍性分離出肺組織及支氣管，沖洗后將肺組織浸泡在4%的多聚甲醛中固定。

2.2 ELISA 法檢測(cè)血清KL-6、IL-6 與IL-17 水平 具體方法，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔與空白孔3 組，3 組分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100 μL、測(cè)樣品100 μL 和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μL，酶標(biāo)板覆膜，予37 ℃溫育1 h，甩干板內(nèi)液體。每孔加入A 工作液 100 μL，37 ℃溫育1 h，棄去液體，甩干，隨即加入B 工作液重復(fù)上述操作。最后每孔加TMR 底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15～20 min，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值（OD 值）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算IL-6、IL-17、KL-6 表達(dá)水平。

2.3 HE 染色法觀(guān)察大鼠肺間質(zhì)病理變化 將浸泡在4%的多聚甲醛中固定的肺組織，固定48 h 后，進(jìn)行包埋、切片、脫蠟、HE 染色、脫水、封片，光鏡下觀(guān)察各組大鼠肺間質(zhì)的病理變化。用Szapiel評(píng)分[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。無(wú)肺泡炎0 分；輕度肺泡炎，受累面積小于全肺20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常1 分；中度肺泡炎，受累面積20%～50%，近胸膜部較重2分；重度肺泡炎，受累面積超過(guò)50%，偶見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞3 分。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來(lái)表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊時(shí)多重比較用Bonferroni,方差不齊時(shí)多重比較用Tamhane；不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U）。

3 結(jié)果

3.1 血清IL-6、IL-17、KL-6 的表達(dá) 血清細(xì)胞因子IL-6、IL-17、KL-6 在對(duì)照組中均顯著升高（P＜0.01）。3 個(gè)相關(guān)指標(biāo)在各治療組均有降低，其中IL-6 在中劑量組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；IL-17在中劑量組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；KL-6 在各治療組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。中、大劑量中藥組與雷公藤組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清指標(biāo)比較（，n =8）pg/mL

表1 大鼠血清指標(biāo)比較（，n =8）pg/mL

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 大鼠肺間質(zhì)病理比較 空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡壁完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大面積破壞，肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大量纖維瘢痕；中藥小劑量組肺泡炎仍然較為明顯，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隙仍較寬，較對(duì)照組有所改善；中藥中、大劑量組及雷公藤組肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，伴有輕微炎癥反應(yīng)及少量纖維增生，與對(duì)照組相比有較明顯的改善（見(jiàn)圖1）。從肺泡炎評(píng)分來(lái)看（如表2），對(duì)照組與空白組炎癥反應(yīng)有明顯區(qū)別（P＜0.01），中藥中大劑量組與對(duì)照組相比肺泡炎癥和纖維化均顯著下降（P＜0.01）,且與中藥小劑量組也有明顯差異（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺間質(zhì)HE 染色結(jié)果（×100）

表2 HE 染色Szapiel 評(píng)分

4 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種復(fù)雜且纏綿難愈的自身免疫性疾病。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺部受累最常見(jiàn)的表現(xiàn)形式，同時(shí)對(duì)患者呼吸系統(tǒng)損傷最為嚴(yán)重，預(yù)后較差[8]。目前，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)肺間質(zhì)病變的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但吸煙已是誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺病的公認(rèn)致病因素，吸煙的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者將比不吸煙的患者增加3 倍以上患間質(zhì)性肺病的機(jī)會(huì)[9]。此外，與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷相關(guān)的抗體類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸（CCP）抗體的持續(xù)升高會(huì)增加類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者患間質(zhì)性肺病的風(fēng)險(xiǎn)，抗環(huán)瓜氨酸抗體可能是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-12]。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程受多種細(xì)胞因子影響，多種炎性細(xì)胞因子促成了以調(diào)節(jié)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程為主的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，其中一部分細(xì)胞因子同時(shí)可作用于肺引起間質(zhì)性肺病。涎液化糖鏈抗原（Krebs Von den Lungen-6,KL-6）是一種與肺泡上皮和肺間質(zhì)損傷相關(guān)的抗原，主要表達(dá)于Ⅱ型肺泡細(xì)胞，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷徙，誘導(dǎo)肺間質(zhì)病變的發(fā)生和發(fā)展，在多種結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病患者血清中發(fā)現(xiàn)KL-6 升高[13]。此外，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素6（IL-6）也與結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病有關(guān)。Zhang Jie 等[14]發(fā)現(xiàn)與特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）或正常肺組織相比，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病患者肺活檢組織中成纖維細(xì)胞聚集和纖維化區(qū)域的IL-17表達(dá)顯著增加。這表明IL-17在肺纖維化中的直接作用，同時(shí)可能與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病特別相關(guān)。魯錦玥等[15]也發(fā)現(xiàn)IL-17 的表達(dá)水平在伴有和不伴有間質(zhì)性肺病的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中有顯著差異，提出IL-17 可以作為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”的范疇?！帮L(fēng)寒濕”三氣雜至合而為痹，因風(fēng)寒濕氣的側(cè)重不同分為風(fēng)、寒、濕痹。本課題認(rèn)為在臨床中因寒致痹的患者具有一定的臨床特點(diǎn)[5]，且與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[16]。芍藥甘草附子湯是張仲景《傷寒論》中的名方，在其基礎(chǔ)上加上雞血藤、青風(fēng)藤構(gòu)成芍甘附子湯加味。方中附子配合甘草辛甘化陽(yáng)，芍藥配甘草酸甘化陰，雞血藤配合青風(fēng)藤補(bǔ)血活血兼通經(jīng)絡(luò)。現(xiàn)代藥理研究[17]發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤也有調(diào)節(jié)免疫的作用，青風(fēng)藤中的青藤堿可以降低IL-1、IL-6 的水平，顯著改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)病理?yè)p傷程度。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍甘附子湯加味在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒證患者中療效較好[5]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明芍甘附子湯加味可通過(guò)調(diào)節(jié)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中的JAK/STAT 通路[6]以及大鼠血清中IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子來(lái)緩解疾病的進(jìn)展[18]。間質(zhì)性肺病作為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的合并癥與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程密切相關(guān)，芍甘附子湯加味能否延緩類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的進(jìn)展值得研究。

本研究中，大鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-17、KL-6水平對(duì)照組較空白組顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明在RA 發(fā)病過(guò)程中一些與致纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子也隨之升高，這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生增多可能促進(jìn)了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的發(fā)生發(fā)展，這與上述相關(guān)文獻(xiàn)描述相一致。同時(shí)在對(duì)大鼠肺臟病理改變的觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組較空白組體現(xiàn)出明顯差異，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡壁完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大面積破壞，肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大量纖維瘢痕。本研究還發(fā)現(xiàn)，芍甘附子湯加味干預(yù)的模型鼠中IL-6、IL-17、KL-6 較對(duì)照組均有明顯降低，其中KL-6降低的水平較另外兩個(gè)細(xì)胞因子更為明顯，且在中藥組大、中、小劑量組與對(duì)照組相比差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柳玉佳等人的研究也發(fā)現(xiàn)KL-6 在RA-ILD 患者血清中明顯升高，同時(shí)中藥可以下調(diào)KL-6 的水平[19]。同時(shí)芍甘附子湯加味干預(yù)的模型鼠肺臟病理均較空白組有改善，以中、大劑量中藥組改善更為明顯。

綜上所述，芍甘附子湯加味可顯著抑制IL-6、IL-17、KL-6 的高表達(dá)，這可能是芍甘附子湯加味防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的有效作用機(jī)制之一。