董小鑫，楊京可，溫玉婷，趙留存

西安市第九醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710054

腎細(xì)胞癌是起源于腎小管上皮的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，占全部腎癌的90%，具有超過10種亞型，包括腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎集合管細(xì)胞癌和未分類腎細(xì)胞癌等，其自然病史及預(yù)后呈多樣性，有的發(fā)展緩慢，有的具有高度侵襲性，給后續(xù)診斷、治療造成很大困擾[1-2]。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌的常見分型，占全部腎細(xì)胞癌的75%左右，致死率高，對常規(guī)放化療不敏感，多數(shù)需進(jìn)行根治性腎切除術(shù)，但早期診斷困難，初診時(shí)往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)預(yù)后不佳[3-4]。因此，探索與腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展分子機(jī)制有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，客觀評估腫瘤潛在的轉(zhuǎn)移性，有效提示腫瘤預(yù)后信息，對腫瘤的治療有重要幫助。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)作為長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)功能，但在身體的各個(gè)組織器官廣泛表達(dá)，參與表觀遺傳調(diào)控，在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等許多病理生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。LINC01296作為lncRNA一員，與卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、肝癌等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等進(jìn)展密切相關(guān)，但在腎透明細(xì)胞癌的影響尚不明晰[6-9]。本研究將檢測LINC01296 在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月至2018 年1 月西安市第九醫(yī)院泌尿外科收治且行根治性腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)的80 例腎透明細(xì)胞癌患者作為研究對象，收集其手術(shù)切除的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本(距癌組織至少3 cm)，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本均經(jīng)過病理檢查，患者術(shù)前未進(jìn)行放化療及其他腫瘤相關(guān)治療，患者對本研究知情同意并簽署紙面聲明，且術(shù)后采用電話、門診等方式完整隨訪3年，截止時(shí)間2021年1月或死亡，記錄患者的生存狀況，患者的臨床、隨訪資料均完整。本研究已通過本醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核并批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 QuantiTect Reverse Transcription Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit (貨號：205314、204243)購自德國QIAGEN；Lightcycler 480 ⅡReal-Time PCR 儀為德國Roche 公司產(chǎn)品。LINC01296、GAPDH引物由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織中LINC01296檢測 將腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織置于冰上解凍，剪成邊界為0.2 cm的立方塊，加入Trizol試劑研磨粉碎、靜置，抽提其中總RNA。總RNA 經(jīng)檢測濃度、完整性合格后，采用QuantiTect Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作步驟依照試劑盒說明書執(zhí)行。采用QuantiTect SYBR Green PCR Kit 配置PCR反應(yīng)體系，在Real-Time PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序：階段1，94℃10 min；階段2，94℃30 s，57℃30 s，72℃45 s，共35個(gè)循環(huán)；階段3(溶解曲線)：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s，讀取產(chǎn)物純度達(dá)到臨界閾值時(shí)對應(yīng)的循環(huán)數(shù)Ct 值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC01296 相對表達(dá)水平，GAPDH 為內(nèi)參基因。LINC01296 正向引物：5′-TAAGGCTGGAGCTGCTCAAC-3′，逆向引物：5′-AGGATCTGGGCTGCAGTCTA-3′；GAPDH 正 向引 物：5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，逆 向 引物：5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 生存曲線分析腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者3年預(yù)后的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織中LINC01296表達(dá)水平比較 腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平為1.86±0.19，明顯高于癌旁組織的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.485，P＜0.05)。

2.2 腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、腫瘤大小的腎透明細(xì)胞癌患者腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、中-高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌患者比較，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌患者腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征腎透明細(xì)胞癌患者腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平比較(±s)

表1 不同臨床病理特征腎透明細(xì)胞癌患者腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平比較(±s)

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2.3 腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平與患者3 年預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪日期，80 例腎透明細(xì)胞癌患者隨訪存活5～36 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為36 個(gè)月，隨訪期間死亡28 例，存活52 例，3 年生存率為65%。以腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平的均值為臨界值，將腎透明細(xì)胞癌患者分為LINC01296 低 表 達(dá) 組45 例，LINC01296 高 表 達(dá) 組35 例。LINC01296 低表達(dá)組3 年總體生存率為77.78%(35/45)，LINC01296 高表達(dá)組3 年總體生存率為48.57%(17/35)；LINC01296 低表達(dá)組3 年總體生存率明顯高于LINC01296高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.382，P＜0.05)，見圖1。

圖1 腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者3年預(yù)后的關(guān)系

3 討論

腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中發(fā)病率、致死率、侵襲轉(zhuǎn)移率最高的組織亞型，對傳統(tǒng)放化療的抵抗也最強(qiáng)，手術(shù)切除是其早中期最主要的治療方式。然而，就診時(shí)已發(fā)生擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的患者達(dá)20%～30%，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差，這與腎透明細(xì)胞癌復(fù)雜的生物學(xué)行為有關(guān)。目前臨床尚缺乏能有效評估腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的指標(biāo)，導(dǎo)致術(shù)后難以進(jìn)行具有針對性的個(gè)體化治療，往往導(dǎo)致術(shù)后癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)迅速而耽誤治療時(shí)機(jī)，或因過度治療浪費(fèi)大量金錢及醫(yī)療資源[10]。因此，尋找新的有效腫瘤標(biāo)志物反映腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展過程，對患者進(jìn)行預(yù)后預(yù)測，以便及早采取更有針對性的個(gè)體化治療，對提高患者生存率具有重要意義。

lncRNA 是一種長鏈的非編碼RNA，被證實(shí)能在包括腎透明細(xì)胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且不僅可作為腫瘤的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，還可作為腫瘤的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)物應(yīng)用于臨床[11-12]。例如，有研究顯示，lncRNA LUCAT1 可通過靶向調(diào)節(jié)miR-199a-5p/HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O 的增殖、遷移過程[13]。lncRNA UCA1 在腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中高表達(dá)，并與Robson分期、TNM分期和組織分化程度密切相關(guān)，可影響患者不良預(yù)后發(fā)生[14]。lncRNA026 在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)lncRNA026 能抑制PI3K/Akt 通路活化，顯著降低腎透明細(xì)胞癌786-O、ACHN細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，有望成為治療腎透明細(xì)胞癌的潛在藥物作用靶點(diǎn)[15]。以上研究均表明，lncRNA差異表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展及癌細(xì)胞生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用，有潛力成為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后、治療靶點(diǎn)，挖掘更多相關(guān)的lncRNA具有重要價(jià)值。

LINC01296 的編碼基因位于人的14q11.2 染色體上，最早被發(fā)現(xiàn)與胚胎發(fā)育有關(guān)，但近年來被許多研究指出其可影響腫瘤細(xì)胞的惡性行為，可能在腫瘤診斷、治療、預(yù)后方面發(fā)揮價(jià)值[6]。例如，張巖等[16]研究表明，LINC01296 與非小細(xì)胞肺癌患者的無進(jìn)展生存期及總生存期獨(dú)立相關(guān)，有潛力成為其預(yù)后的生物標(biāo)志物。李信等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01296 在乳腺癌中高表達(dá)，并參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后關(guān)系密切，有潛力成為乳腺癌預(yù)后預(yù)測及治療的靶點(diǎn)。SAEIDI 等[18]通過系統(tǒng)評價(jià)和薈萃分析表明，LINC01296 表達(dá)與癌癥患者的TNM 分期、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，較短的總生存期與LINC01296 高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，并認(rèn)為LINC01296 可能是癌癥患者的潛在生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高，表明LINC01296 在腎透明細(xì)胞癌中差異表達(dá)，可能參與腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LINC01296在不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中表達(dá)差異顯著，而在不同年齡、性別、腫瘤大小的患者癌組織中表達(dá)無顯著差異，表明LINC01296表達(dá)可一定程度反映腎透明細(xì)胞癌患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，且可能參與這些進(jìn)展。此外，隨訪3 年結(jié)果顯示80例腎透明細(xì)胞癌患者存活52 例(3 年生存率為65%)，以腎透明細(xì)胞癌組織中LINC01296 表達(dá)水平均值為界限將患者分高、低表達(dá)組，通過Kaplan-Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，LINC01296低表達(dá)組的3年總體生存率高于LINC01296高表達(dá)組，表明LINC01296表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者3年預(yù)后情況相關(guān)，有潛力成為腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

綜上所述，LINC01296 在腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及3年預(yù)后情況關(guān)系密切，有潛力成為反映腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征及3年預(yù)后情況的生物標(biāo)志物。