曹石金，羅錦斌，何海填，張新明，葉宗岳，曾燦，王可兵

深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518067

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一類嚴(yán)重威脅男性生命健康的惡性腫瘤。據(jù)美國癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)：2016年P(guān)Ca 新發(fā)病占男性惡性腫瘤新發(fā)病例的21%，位列男性惡性腫瘤第1 位；死亡病例占惡性腫瘤死亡病例總數(shù)的8%，排名全球第2 位[1]。母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene3，MEG3)是一段長度約1.6 kb的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，定位于人類染色體14q32.3中的印記基因[2]。已有較多文獻(xiàn)報(bào)道MEG3是抑癌基因，在多種癌組織中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)缺失[3]。MEG3 作為一個(gè)經(jīng)典的抑癌基因[4]，既可作為PCa診斷的生物標(biāo)志物，又能調(diào)控PCa的進(jìn)程，然而目前MEG3調(diào)控PCa的分子生物學(xué)機(jī)制仍知之甚少。本文首先用實(shí)驗(yàn)明確了MEG3 在PCa 組織中的表達(dá)情況，再用生物信息學(xué)方法預(yù)測MEG上游轉(zhuǎn)錄因子、下游靶miRNA 及靶miRNA 的靶基因，并繪制了其整個(gè)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究MEG3 在PCa 發(fā)生中的分子生物學(xué)機(jī)制提供了新線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年7 月至2020 年5 月深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院收治的20 例PCa 患者行前列腺穿刺活檢術(shù)及根治術(shù)獲取的樣本作為Tumor組，20例經(jīng)尿道前列腺剜除術(shù)的良性前列腺增生組織標(biāo)本作為Normal 組。Tumor 組患者平均年齡(69.87±3.66)歲，平均病程(9.06±1.18)年。Normal組患者平均年齡(70.06±4.13)歲，平均病程(9.31±2.01)年。兩組患者的年齡和病程比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用預(yù)冷的TRIzol(Invitrogen)提取樣本組織中總RNA，檢測合格后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Power SYBR Green(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行操作后，將20 μL反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)。MEG3上游引物：5′-CTGCCCATCTACAC CTCACG-3′；下 游 引 物：5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′。內(nèi)參基因選GAPDH 上游引物：5′-TGCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′；下 游 引 物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。上機(jī)檢測后，按2-△△Ct法計(jì)算MEG3基因相對表達(dá)量。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測 在UCSC 數(shù)據(jù)庫(http：//genome.ucsc.edu)查詢MEG3 在人類基因組中的定位及其保守性。用PROMO 數(shù)據(jù)庫(http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？ dirDB=TF_8.3)預(yù)測MEG3 啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄因子。用DIANA生物學(xué)軟件(http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php? r=site/index )預(yù)測MEG3 下游靶miRNA。用miRTarBase 軟 件(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php)在線預(yù)測MEG3 下游靶miRNA的靶基因，并繪制MEG3與PCa 發(fā)生有關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的MEG3基因表達(dá)水平比較 Tumor組患者的MEG3 表達(dá)水平為2.64±0.305，明顯低于Normal 組的8.23±0.759，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩組MEG3基因表達(dá)水平比較

2.2 MEG3在人類基因組中的定位及保守性 運(yùn)用UCSC 基因組工具[Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly] 明確MEG3 在人類基因組中的定位。MEG3 定位于人類14q32.3 染色體的100826118～100861026之間，見圖2。MEG3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)具有較高的保守性，見圖3。

圖2 UCSC基因組工具分析MEG3在人類基因組中的定位

圖3 UCSC基因組工具分析MEG3在人類基因組中的保守性

2.3 MEG3 與上游序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 首先運(yùn)用UCSC 數(shù)據(jù)庫得到MEG3 啟動(dòng)子序列后，在PROMO 數(shù)據(jù)庫中，將容錯(cuò)率設(shè)置為0%的情況下預(yù)測MEG3啟動(dòng)子序列，共有18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括YY1、C/EBPβ、GR-α等，見圖4。

圖4 MEG3啟動(dòng)子序列上的轉(zhuǎn)錄因子

2.4 MEG3與miRNA 運(yùn)用DIANA生物學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測，Threshold 調(diào)為0.8，結(jié)果可得到與MEG3 結(jié)合的miRNA 共有32 個(gè)。通過檢索文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合評分大于0.9 以上，且在腫瘤研究中相對廣泛的hsa-miR-877-3p進(jìn)一步分析。

2.5 miR-877-3p 與靶基因 運(yùn)用miRTarBase軟件在線預(yù)測hsa-miR-877-3p 靶基因，統(tǒng)計(jì)Pred.Score≥0.800 分的基因共有40 個(gè)。選取與PCa 相關(guān)的3 個(gè)基因包括小泛素相關(guān)蛋白1(small ubiquitin related modifier 1，SUMO1)、富亮氨酸纖維連接蛋白跨膜2(fibronectin leucine rich transmemrane 2，F(xiàn)LRT2)、人類免疫缺陷病毒I 型增強(qiáng)子結(jié)合蛋白3(human immunodeficiency virus type I enhancer binding proteins，HIVEP3)等。

2.6 繪制MEG3 在PCa表達(dá)的分子調(diào)控網(wǎng)格經(jīng)總結(jié)分析，對MEG3在PCa的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制，如圖5所示。

圖5 MEG3參與PCa發(fā)病的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

PCa 是泌尿外科臨床上常見的惡性腫瘤之一，隨著我國平均壽命的延長，其臨床發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[5]。早期PCa 患者經(jīng)過綜合治療后，預(yù)后通常良好[6]，然而目前仍有相當(dāng)一部分PCa 患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。雖然內(nèi)分泌治療可以在一定程度上控制和改善多數(shù)中晚期PCa 患者的病情，但其中絕大多數(shù)患者仍會(huì)進(jìn)展為預(yù)后極差的去勢抵抗性PCa[7-8]。因此，深入探尋PCa 發(fā)生發(fā)展的分子通路及相關(guān)基因異常，闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找其轉(zhuǎn)移及耐藥的分子機(jī)制及有效靶點(diǎn)，對于提高PCa的早期診斷效率、發(fā)掘新的治療靶點(diǎn)與預(yù)后判斷方法具有重要意義。

生物信息學(xué)(bioinformatics)是在人類基因組計(jì)劃下快速興起的一門新興交叉學(xué)科，主要涉及計(jì)算機(jī)、生物學(xué)和數(shù)學(xué)等多門學(xué)科的綜合技術(shù)應(yīng)用[9]。隨著基因測序技術(shù)及數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展，臨床研究采用生物信息學(xué)深度挖掘與人類疾病有關(guān)的測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)新的分子信號通路已成為可能。并且該法具有經(jīng)費(fèi)投入少、樣本量大和能優(yōu)化處理大量數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，為初步篩選有價(jià)值的分子標(biāo)志物和繼續(xù)深度研究提供了新線索[10]。利用生物信息學(xué)軟件分析相應(yīng)基因，從而提升研究方案的科學(xué)性和邏輯性，從而進(jìn)一步使具體的深度研究更有針對性和目標(biāo)性，能大幅度節(jié)約試驗(yàn)的工作量。LncRNA是一種轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，其參與了機(jī)體免疫調(diào)控、X 染色體沉默、染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄干擾等調(diào)控過程，可在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)[11-12]。目前，越來越多的lncRNA 被鑒定和研究，而在眾多l(xiāng)ncRNA 中，MEG3 的研究比較深入，其被發(fā)現(xiàn)在許多癌癥如肝癌、白血病和腦癌等中表達(dá)缺失[13]。

本研究首先分析了MEG3在PCa組織和良性前列腺增生組織的基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示MEG3 在Tumor 組中的表達(dá)明顯低于Normal 組，揭示了MEG3 在PCa 中也存在表達(dá)缺失的情況。為了進(jìn)一步了解MEG3 在PCa 的分子生物學(xué)機(jī)制，本文進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法預(yù)測及繪制MEG3在PCa的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究用UCSC基因組工具明確MEG3在人類基因組中的定位，MEG3 定位于人類14q32.3 染色體的100 826 118～100 861 026 之間；確定了MEG3 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)具有較高的保守性；用PROMO 數(shù)據(jù)庫預(yù)測MEG3 啟動(dòng)子序列一共有18 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括YY1、C/EBPβ、GR-α等；用DIANA 生物學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測得到與MEG3 結(jié)合的miRNA 共有32 個(gè)，且結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，篩選評分大于0.9以上，選在腫瘤研究中相對廣泛的hsa-miR-877-3p進(jìn)一步分析。已有研究表明，在乳腺癌中miR-877-3p 表達(dá)缺失，而人類表皮生長因子受體2(HER-2)則過表達(dá)，在進(jìn)一步機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，miR-877-3p mimic能降低細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)功能，這揭示了miR-877-3p 在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[14]。另外，在膀胱癌細(xì)胞中miR-877-3p和p16 基因均表達(dá)缺失，過表達(dá)miR-877-3p 能有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、平板克隆和皮下成瘤能力，其抑癌作用可能與特異性激活p16 基因表達(dá)有關(guān)[15]。為了進(jìn)一步了解hsa-miR-877-3p 調(diào)控的靶基因，作者采用miRTarBase 軟件在線預(yù)測其靶基因，統(tǒng)計(jì)Pred.Score≥0.800 分的基因共有40 個(gè)，選取與PCa 相關(guān)的3 個(gè)基因包括SUMO1、FLRT2、HIVEP3 等，最后對MEG3 在PCa 中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了繪制。SUMO 參與了SUMO化的修飾過程，其蛋白分子量約為12 kD。SUMO 化修飾是一種蛋白翻譯后的修飾，在調(diào)節(jié)幾乎所有細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要的作用[16]。SUMO化修飾失調(diào)可能參與了人類疾病，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[17]。我國研究者發(fā)現(xiàn)壯觀霉素B1和四逆湯均能通過下調(diào)人非小細(xì)胞肺癌A549中SUMO1 和p-Akt 表達(dá)，和上調(diào)PETN 和Caspase-9 表達(dá)，從而降低細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移力[18]。國外有研究者發(fā)現(xiàn)通過去SUMO 化修飾能誘導(dǎo)HIF1α依賴型的血管生成及提高PCa 細(xì)胞的增殖力[19]。FLRT 家族首次由Lacy 在1999 年在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，其家族成員包括FLRT1、FLRT2 和FLRT3。FLRT 家族成員主要通過參與細(xì)胞分選、黏附、縮聚，以及對成纖維細(xì)胞生長因子信號及其受體的共同作用而在脊椎動(dòng)物的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[20]。近來有國外研究者為了開發(fā)新的手段用來區(qū)分惰性PCa 和侵襲性PCa，利用了綜合高通量陣列相對甲基化分析整個(gè)基因組差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions，DMRs)，包括基于Gleason 分級的PCa 患者CpG島(CGI)和非CGI 區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gleason 等級低vs高比較中排名前5 的候選DMRs 中，就包括了OPCML、ELAVL2、EXT1、IRX5和FLRT2，這揭示了FLRT2異常表達(dá)與PCa 密切相關(guān)[21]。HIVEP3，也被稱為KBP-1、KBP1、KRC、SHN3、Schnurri-3、ZAS3 和ZNF40C，是HIVEP 家族成員之一。據(jù)研究表明，HIVEP3 在免疫球蛋白基因重排、細(xì)胞存活、巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、輔助T 淋巴細(xì)胞中IL-2 基因表達(dá)、成骨細(xì)胞骨形成、腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[22]。近來我國有研究者通過采用RNA 干擾在PCa 細(xì)胞系中敲除SOX9表達(dá)，并在體外分析SOX9 抑制對HIVEP3表達(dá)的影響，并用定量PCR 和免疫組化方法檢測了人類PCa 組織中HIVEP3 和SOX9 的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9 過表達(dá)會(huì)激活HIVEP9 表達(dá)，這可能是PCa 患者預(yù)后不良的重要因素，并提示聯(lián)合分析HIVEP9 和SOX9 表達(dá)情況有助于預(yù)測PCa 患者的腫瘤進(jìn)展和預(yù)后情況[23]。然而，這一系列推導(dǎo)出的MEG3 在PCa 的分子調(diào)控通路仍需進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本文證實(shí)了MEG3 在PCa 中存在表達(dá)缺失的情況。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測分析顯示與PCa 相關(guān)且可能與MEG3 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(YY1、XBP-1 和FOXP3 等)、miR-877-3p 和miR-877-3p 靶基因(SUMO1、FLRT2 和HIVEP3)相互關(guān)聯(lián)，并構(gòu)成以MEG3 為核心的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究MEG3 在PCa 發(fā)生中的分子生物學(xué)機(jī)制提供了新線索。