張萍，魏佳佳，楊永建，劉池，蘇漢林，張珍明

（1.連云港職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技產(chǎn)業(yè)處，江蘇 連云港 222006；2.江蘇海洋大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.南通市愛灸堂保健用品有限公司，江蘇 南通 226000）

艾草是一種菊科多年生草本植物，其植株有清冽芳香氣味，具有抗菌、抗炎癥、抗衰老等功效。艾草在傳統(tǒng)中醫(yī)藥防疫中的應(yīng)用歷史十分悠久，艾葉熏蒸的防疫應(yīng)用十分廣泛[1]。艾草提取物已經(jīng)被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的藥理研究證明，其抗菌譜較寬，能夠有效抑制甚至殺死很多細(xì)菌和病毒，能在一定程度上抵御呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)艾草各部位的化學(xué)成分進(jìn)行了較為廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)艾草中主要活性成分可依據(jù)沸點(diǎn)不同分為揮發(fā)性化合物：精油、萜類，非揮發(fā)性化合物：黃酮、酚酸和多糖類[3]。不同種屬、產(chǎn)地、提取方式的艾草的化學(xué)成分之間存在較大差別。艾草提取物還對(duì)糖尿病和癌癥疾病有治療和預(yù)防的作用，可抑制細(xì)胞炎癥和凋亡的發(fā)生，抗血小板的生成，同時(shí)促進(jìn)血管的舒張[4]。艾草作為綠色、純天然、可食用的野生中草藥，在中國(guó)分布廣泛，開發(fā)其營(yíng)養(yǎng)、藥用和商用價(jià)值的前景十分廣闊。艾葉是艾草的干葉，主要的生物活性成分是有機(jī)酸、揮發(fā)油和黃酮類化合物，艾葉中有機(jī)酸的生物活性主要是抗病毒、清除自由基等。艾葉油的生物活性是抗菌、抗氧化等。目前艾葉精油的常用提取方法一般包括水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨CO2萃取法、微波輔助萃取法等[5-6]。

筆者以石油醚為溶劑，采用索氏萃取法提取出艾葉精油，并與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法做對(duì)比。通過氣質(zhì)聯(lián)用色譜，結(jié)合指紋圖譜，確定精油的成分及含量，并通過抑菌實(shí)驗(yàn)探討艾葉精油的抑菌活性。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器

索氏提取儀YSXT-06（上海熙楊有限公司），水蒸氣蒸餾儀HB-101A（慈溪市宏邦電器有限公司），電子天平Y(jié)P 1201N（上海精密儀器有限公司），循環(huán)水式真空泵RE-52A（南京金正儀器教學(xué)有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-32（上海亞榮生化儀器），破壁攪拌機(jī)800Y（永康市鉑歐五金制品有限公司），氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀BD9-GC-4003A（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm,0.25 μm）。

1.2 藥品和試劑

艾草樣品采于江蘇南通，石油醚（30～60℃），供試菌株為金黃葡萄球菌、大腸桿菌、白色念球菌病原菌，由江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；供室培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于金黃葡萄球菌和大腸桿菌）、PDA培養(yǎng)基（用于白色念球菌）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 艾葉精油提取

2.1.1 索氏萃取法

將艾葉洗凈，瀝干，切碎，取出50 g，用200 mL石油醚浸泡2 h，轉(zhuǎn)移至索氏提取儀中提取，艾葉碎用濾膜包住放入萃取管中，加熱回流至萃取管中溶液顏色較淺，待恰好完成一次虹吸時(shí)停止萃取，減壓蒸餾，得淺黃色有特殊清香氣味的液體2.135g，收率4.27%。

2.1.2 水蒸氣蒸餾法

將100g切碎的艾葉，加入200mL蒸餾水，浸泡2h，參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）》四部中揮發(fā)油測(cè)定法甲法測(cè)定艾葉揮發(fā)油[7]203-204。浸泡完畢后倒入圓底燒瓶中，煮沸后保持微沸狀態(tài)，待餾出液沒有油產(chǎn)生時(shí)關(guān)閉水蒸氣發(fā)生裝置，得藍(lán)綠色液體0.14g，收率0.14%。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 供試品溶液制備

分別取兩種不同方法制取的艾草精油20mg，精密稱定，分別置于2mL容量瓶中，加正己烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2 GC-MS檢測(cè)

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度240℃；載氣（He）流量：1mL/min；分流比：20：1；進(jìn)樣量：1μL；溶液延遲：6.5 min。程序升溫過程如下：初始溫度50℃，以3℃/min速率升溫至75℃，保持溫度15 min，以10℃/min的速率升溫至175℃，保持3 min，以20℃/min的速率升溫至240℃，保持3 min，260℃后運(yùn)行3 min。

質(zhì)譜條件：電離方式EI離子源；電離電壓70eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；接口溫度250℃；質(zhì)量范圍60~300 m/z。

2.3 艾葉精油的抗菌性測(cè)定

2.3.1 含藥平板制備

按配方制備培養(yǎng)基，過濾分裝至錐形瓶中，加塞包扎，0.1 MPa壓力滅菌20min，擱置斜面，做無菌檢測(cè)后將其倒入內(nèi)徑一致、事先放置平面的培養(yǎng)皿中，凝固后干燥，以平板中沒有可見水滴為基準(zhǔn)。

2.3.2 指示菌菌懸液涂布

按稀釋涂布平板法，將各菌種用移液槍準(zhǔn)確量取1mL，放入盛有9mL的試管中，振搖約20min，使細(xì)菌分散，用一支1mL無菌吸管吸取1mL稀釋菌液，加入盛有9mL無菌水的試管中并充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-2、10-3、10-4稀釋度的菌液。用無菌管分別從10-2、10-3、10-4稀釋度的菌液中吸取0.2 mL對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中央位置，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿按標(biāo)記好的位置均勻放置牛津杯。吸取一定濃度的艾草精油0.2 mL至標(biāo)記好的牛津杯中。將金黃葡萄球菌及大腸桿菌對(duì)應(yīng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放置無菌溫室中28℃培養(yǎng)2d，白色念球菌對(duì)應(yīng)的PDA培養(yǎng)基放置無菌溫室中28℃培養(yǎng)3d。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 兩種提取方法比較

索氏萃取法收率4.27%，顯著高于水蒸氣蒸餾法0.14%的收率。水蒸氣蒸餾裝置由水蒸氣發(fā)生裝置、蒸餾裝置、冷凝裝置和接收裝置4個(gè)部分組成，在提取揮發(fā)油時(shí)，收集油相后再進(jìn)行二次回流提取，仍能收集到少量揮發(fā)油，并不能一次有效地將水溶性較強(qiáng)的揮發(fā)油充分提取，故水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油得率較低[8]。但水蒸氣蒸餾法工藝簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、環(huán)保、生產(chǎn)成本低。有機(jī)溶劑萃取法所需設(shè)備簡(jiǎn)單、投資小，精油提取率高，但是此法提取的植物精油純度較低，產(chǎn)品中殘留溶劑難以除去[9]。

3.2 精油成分解析

根據(jù)GC-MS譜圖，對(duì)照NIST 14指紋標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)，CAS號(hào)查詢確認(rèn)化合物歸屬，總離子流圖峰面積歸一法測(cè)定各化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。索氏法提取艾葉精油中約含35種不同的物質(zhì)，水蒸氣蒸餾法提取艾葉精油中含47種不同的物質(zhì)。

表1 GC-MS檢測(cè)分析艾葉精油成分及含量

續(xù)表1

續(xù)表1

其中桉油精、β-石竹烯、氧化石竹烯、α-松油醇、β-側(cè)柏酮、順-4-側(cè)柏醇、1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-醇、α-雪松烯、葉綠醇、（-）-藍(lán)桉醇和淚柏醚等11種成分是兩種提取方法共有的，分別占索氏法和水蒸氣法提取精油總量的54.35%和26.77%。艾葉精油的主要有效成分，桉油精又稱1,8-桉葉油素，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、配制牙膏香精或調(diào)味品中，具有抗菌、抗炎、殺蟲、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)透皮吸收等作用，是《中國(guó)藥典》中艾葉含量測(cè)定的指標(biāo)成分。β-石竹烯具有局部麻醉作用和治療結(jié)腸炎作用[10]。α-松油醇有刺激胰島素的能力，能降低血糖，能促進(jìn)肌酸的吸收,常作為肌酸產(chǎn)品添加劑。索氏法和水蒸氣法提取精油中的桉油精、β-石竹烯和α-松油醇分別占揮發(fā)油總量的13.86%、5.97%、6.20%和5.57%、3.93%、1.39%。索氏法提取的艾葉揮發(fā)油中3種有效成分的含量均高于水蒸氣蒸餾法。

3.3 精油的抑菌效果

依次量取艾草精油，考察對(duì)3種菌種的抑制效果，透明圈直徑見表2。

表2 艾葉精油對(duì)不同菌種的抑菌直徑

根據(jù)抑菌圈直徑，索氏法提取精油對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌直徑為11.2 mm，處于10mm＜d＜14 mm，對(duì)金黃葡萄球菌有中敏感度，對(duì)大腸桿菌抑菌直徑為19.3mm，d＞14 mm，對(duì)大腸桿菌有高敏感度，對(duì)白色念球菌的抑菌直徑d＜10 mm，對(duì)白色念球菌有低敏感度；水蒸氣蒸餾法提取精油對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌直徑d＜10 mm，對(duì)金黃葡萄球菌有低敏感度，對(duì)大腸桿菌抑菌直徑d＜10 mm，對(duì)大腸桿菌有低敏感度，對(duì)白色念球菌沒有抑菌作用。索氏萃取法對(duì)三個(gè)菌種的抑菌作用高于水蒸氣蒸餾法。