王乃馨，李 超，苗敬芝，曹澤虹，李 文，邵 穎

（徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)試驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappaL.）又名為大力子、東洋參等，自20世紀(jì)90年代開始就在我國作為經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行推廣種植。江蘇省徐州市豐縣、沛縣兩地是我國重要種植基地之一。作為一種藥食同源的植物種類，牛蒡營養(yǎng)豐富，其根狀莖中蛋白質(zhì)、菊糖、精氨酸、天冬氨酸、鎂、鐵、鋅等礦物質(zhì)元素及維生素C（vitamin C，VC）、維生素B6（vitamin B6，VB6）等含量較高[1]，還含有醛類、牛蒡酸類、硫炔類、多酚類等多種活性成分以及膳食纖維，被證實(shí)具有較好的抑菌功效和促進(jìn)腸胃蠕動效果[2-4]。新鮮牛蒡脆嫩多汁，具有明顯的甜味，若挖掘采收后保存不當(dāng)，嫩莖極易老化，發(fā)韌發(fā)硬，影響了作為蔬菜的口感。通過切片烘干等工藝制成的飲片不僅強(qiáng)化了原本略帶土腥味的缺陷，而且使口味偏苦，喪失原有的清甜風(fēng)味。

酵素是一種新型微生物發(fā)酵品，可在一定程度上改良原料風(fēng)味、避免口感變差的問題。因原料種類、發(fā)酵菌種、發(fā)酵環(huán)境等條件差異，酵素在生產(chǎn)過程中發(fā)生理化變化，使原料中大分子被分解或轉(zhuǎn)化成小分子代謝產(chǎn)物或者新的功能性物質(zhì)[5-6]。酵素產(chǎn)品具有抗氧化[7-8]、提高免疫力[9-10]、降血脂、控體質(zhì)量[11-12]、改善腸道功能及菌群[13-14]等功效。美國天然保健品市場2013年草藥類膳食補(bǔ)充劑銷售額就已經(jīng)達(dá)9.94億美元，其中鳳梨酵素為875.59萬美元[15]。亞洲地區(qū)有成熟的酵素生產(chǎn)企業(yè)，如臺灣大漢酵素生物科技股份有限公司[16]、日本萬田和大高公司和佰納吉公司[17]。目前國內(nèi)已有大量高校和企業(yè)在酵素發(fā)酵方面投入大量時(shí)間和資源進(jìn)行研究。但由于前期工作仍在積累中，僅有中華人民共和國工業(yè)和信息化部在2018年發(fā)布的《植物酵素》[18]和《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》[19]這兩個(gè)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和少量團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，尚無國家標(biāo)準(zhǔn)。我國酵素品質(zhì)體系、檢測方法、制作方法有待進(jìn)一步完善。目前，已有關(guān)于牛蒡酵素的研究報(bào)道。王乃馨等[20]以牛蒡?yàn)橹饕?，混合多種蔬菜與水果制備酵素，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了酵素配方，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力最高可達(dá)43.80 U/mL。張艷明等[21]以氣調(diào)糖化后的牛蒡、紫皮葡萄為原料，制備葡萄牛蒡酵素并確定了最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

本研究以牛蒡?yàn)橹饕?，?fù)合橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜等果蔬，以米曲霉（Aspergillus oryzae）為發(fā)酵菌種，制備牛蒡復(fù)合果蔬酵素。以超氧化物歧化酶（SOD）活性為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其發(fā)酵條件。并考察發(fā)酵過程中功效酶（SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶）活性以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-diazo-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除率的動態(tài)變化，以期為牛蒡復(fù)合果蔬酵素的生產(chǎn)工藝優(yōu)化和綜合性開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛蒡：徐州綠姿農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社；枸杞：寧夏活性農(nóng)副產(chǎn)品購銷有限公司；橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜、白砂糖：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；福林酚、DPPH、ABTS、酪蛋白、鄰二氮菲、抗壞血酸（均為生化試劑或分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；硼酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、雙氧水、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、甲醇、甲醛和碳酸鈉（均為分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-C水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇恒農(nóng)儀器廠；101A-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；UV-2100紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZJP-A1430電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；PHS-3E pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；3K30冷凍高速離心機(jī)：德國Sigma公司；SW-CJ-2FD垂直潔凈凈化超凈工作臺：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡復(fù)合果蔬酵素加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜用純水清洗后去皮、去蟲眼、去核，包菜、芹菜去老葉、黃葉，均切成1 cm3左右的方塊，枸杞清洗瀝干后直接使用。新鮮牛蒡徹底清洗除去泥沙、細(xì)根須等雜物，浸泡在純水中快速去皮、切去老根，以避免切口快速褐變。迅速將牛蒡切成1 cm3左右小塊投入發(fā)酵罐。果蔬原料比例為牛蒡20%，山楂18%、枸杞11%、蘋果4%、其他水果蔬菜47%。調(diào)整料液比為1∶1.5（g∶mL）。

添加菌種、調(diào)整糖度：米曲霉孢子按一定比例加入發(fā)酵罐中，按原料質(zhì)量15%的比例添加白糖，混合均勻。

控溫發(fā)酵：發(fā)酵罐體內(nèi)應(yīng)留有一定空間，密閉后進(jìn)行控溫發(fā)酵。期間根據(jù)發(fā)酵情況需適時(shí)開罐放氣以防爆罐。至49 d完成發(fā)酵，跟蹤檢測發(fā)酵過程中酵素品質(zhì)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用400目濾布濾去發(fā)酵液中果蔬渣，再用0.2 μm孔徑濾膜過濾除菌后灌裝，于陰涼避光處儲存。

1.3.2 牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法，分別考察發(fā)酵溫度（29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃、33 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（3 d、7 d、14 d、21 d、28 d）、菌種接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性的影響。

1.3.3 牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酵素的SOD活性（Y）為響應(yīng)值，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和米曲霉孢子接種量（C）為主要考察因素，采用Design-Expert V10.0.3軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

（1）產(chǎn)品理化指標(biāo)檢測

總酸的測定：參照國標(biāo)GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》[22]；酒精的測定：采用酒精計(jì)；可溶性固形物測定：采用阿貝折光儀；pH值測定：采用pH計(jì)。

（2）酶活性

SOD活性的測定：參照國標(biāo)GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》[23]；淀粉酶活性的測定：參照靳利娥等[24]的試驗(yàn)方法；蛋白酶活性測定：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[25]；脂肪酶活性的測定：參照國標(biāo)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》的指示劑滴定法[26]。

（3）抗氧化性能

DPPH自由基清除率的測定：參考LUO W等[27]的試驗(yàn)方法；羥自由基清除率的測定：參考ZHANG Z F等[28]的試驗(yàn)方法；ABTS自由基清除率的測定：參考RE R等[29]的試驗(yàn)方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2007、SPSS22.0分析軟件進(jìn)行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對酵素品質(zhì)影響

發(fā)酵溫度對牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性影響的結(jié)果如圖1所示，隨著發(fā)酵溫度在29～32 ℃范圍內(nèi)的不斷升高，酵素中的SOD活性不斷提升，其原因可能是，發(fā)酵溫度越來越接近米曲霉生長的最佳溫度，利于酶促反應(yīng)和微生物代謝發(fā)育[30]；發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值，為（30.83±0.48）U/mL；繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，SOD活性有所下降。只有將發(fā)酵溫度控制在合適的范圍才能促進(jìn)微生物生長，利于酵素次級代謝產(chǎn)物的積累。因此，最終選取發(fā)酵溫度31 ℃、32 ℃、33 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵溫度對牛蒡復(fù)合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對酵素品質(zhì)影響

發(fā)酵時(shí)間對牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性影響的結(jié)果如圖2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間在3～21 d內(nèi)的增加，SOD活性快速增加；發(fā)酵時(shí)間為21 d時(shí)，酵素中SOD活性達(dá)（46.08±2.84）U/mL；當(dāng)繼續(xù)增加發(fā)酵時(shí)間，SOD活性增長變緩。因此，最終選取發(fā)酵時(shí)間14 d、21 d、28 d進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對牛蒡復(fù)合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation time on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.3 接種量對酵素品質(zhì)影響

接種量對牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性影響的結(jié)果如圖3所示，隨著接種量在1%～3%范圍內(nèi)的不斷增加，SOD活性隨之提升，至接種量為3%時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值，為（38.46±0.62）U/mL，再增加接種量，SOD活性略有下降。其原因可能是在發(fā)酵過程中，接種量較低時(shí)，發(fā)酵能力較低，接種量過高時(shí)，因初始發(fā)酵液中營養(yǎng)有限，不能滿足全部微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)限制了其生長。因此，最終選取接種量1%、2%、3%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 接種量對牛蒡復(fù)合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculum on superoxide dismutase activity of burdockcompound fruit and vegetable Jiaosu

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）3個(gè)因素為自變量，以SOD活性（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，經(jīng)Design-Expert 10.0.3數(shù)據(jù)分析軟件對響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，方差分析見表2。

各因素水平對牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性影響的二次回歸擬合方程如下：

由表2可知，牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化回歸模型的P值＜0.000 1，差異極顯著，失擬項(xiàng)的P=0.079 5＞0.05，差異不顯著，模型決定系數(shù)R2=0.999 0，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.997 7，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.43%。說明發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)際情況擬合度良好，可以穩(wěn)定重現(xiàn)，能夠?qū)ε］驈?fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝條件進(jìn)行預(yù)測。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)建模優(yōu)化分析，得到牛蒡復(fù)合果蔬酵素SOD活性的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度32.054 ℃、發(fā)酵時(shí)間25.789 d、接種量2.440%，該條件下SOD活性預(yù)測值為（48.233±0.480）U/mL。根據(jù)試驗(yàn)所需條件及實(shí)際的可操作性，將牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝條件修正為：發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間26 d、接種量2.5%，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，對試驗(yàn)結(jié)果取平均值，得牛蒡復(fù)合果蔬酵素的SOD活性實(shí)際值為（50.083±1.950）U/mL，與預(yù)測值差異不大，說明響應(yīng)面法對牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化具有實(shí)際可行性，可為后續(xù)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

2.3 牛蒡復(fù)合果蔬酵素品質(zhì)在發(fā)酵過程中的變化

2.3.1 發(fā)酵過程中酶活性變化

不同功效酶活性變化如圖4所示。發(fā)酵時(shí)間在0～13 d范圍內(nèi)，淀粉酶活性逐漸增強(qiáng)，淀粉酶活性由（25.06±1.34）U/mL升至最高值（68.55±1.20）U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，淀粉酶活性基本穩(wěn)定在44 U/mL左右；發(fā)酵時(shí)間在0～26 d范圍內(nèi)，SOD活性由（24.17±0.80）U/mL升至最高值（52.09±1.02）U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，SOD活性基本穩(wěn)定在48 U/mL左右；在整個(gè)發(fā)酵過程中，蛋白酶活性偏低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在0～5 d范圍內(nèi)，蛋白酶活性由最初的（12.16±1.24）U/mL升至最高值（18.55±0.81）U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長，蛋白酶活性維持在緩慢下降狀態(tài)；發(fā)酵時(shí)間在0～19 d范圍內(nèi)，脂肪酶活性由最初的（2.67±0.67）U/mL升至（6.78±0.81）U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，脂肪酶活性約穩(wěn)定在7 U/mL。各種酶活性在發(fā)酵過程中存在差異，但均呈現(xiàn)先增加后減少然后基本穩(wěn)定這一變化規(guī)律，與相關(guān)研究結(jié)果一致[31-32]。通過發(fā)酵處理可以明顯提升部分功能酶活力，酶活性較好的發(fā)酵時(shí)間為13～26 d。部分研究也證明了當(dāng)植物酵素發(fā)酵到后期時(shí)，除了部分微生物代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、小分子物質(zhì)緩慢積累，其他活性或成分一般不斷減少[7，20]。

圖4 發(fā)酵過程中牛蒡復(fù)合果蔬酵素的不同酶活性變化Fig.4 Changes of different enzyme activities of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.2 發(fā)酵過程中抗氧化活性變化

抗氧化活性變化如圖5所示，在發(fā)酵過程中，不同自由基清除率總體呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定或略微降低的規(guī)律。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在0～26 d的范圍內(nèi)，ABTS自由基清除率由最初（51.27±0.65）升至（68.71±0.41）%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，ABTS自由基清除率有所下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在0～21 d的范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率由最初（47.61±0.45）%上升至（60.57±0.25）%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，DPPH自由基清除率下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在0～26 d的范圍內(nèi)，羥自由基清除率由最初（45.08±0.25）%上升至（56.36±1.06）%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，羥自由基清除率下降。通過發(fā)酵，均可以在不同程度提升這三種自由基的清除率。但各種自由基清除率的變化并不完全與SOD活性的變化一致，可能是其他成分影響了抗氧化效果。因此，自由基清除率較好的發(fā)酵時(shí)間為20～26 d。

圖5 發(fā)酵過程中牛蒡復(fù)合果蔬酵素的抗氧化性變化Fig.5 Changes of antioxidant activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.3 牛蒡復(fù)合果蔬酵素的理化指標(biāo)及感官評價(jià)

牛蒡復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵49 d后，發(fā)酵液中總酸含量為（4.78±0.59）mg/mL，pH值為（3.32±0.42），可溶性固形物含量為（5.27±0.71）%，酒精度為（1.50±0.73）%vol。發(fā)酵產(chǎn)品顏色呈淡黃褐色，基本透明，口感清爽微酸，具有略帶青椒氣味的果蔬風(fēng)味。

3 結(jié)論

以超氧化物歧化酶（SOD）活性為評價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時(shí)間26 d，接種量2.5%，在該條件下，SOD活性達(dá)（52.09±1.02）U/mL。延長發(fā)酵時(shí)間至49 d，其功能酶（SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）活性和DPPH、ABTS、羥自由基清除率變化均呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵完成后，總酸、可溶性固形物、酒精度分別為（4.78±0.59）mg/mL、（5.27±0.71）%、（1.50±0.73）%vol，呈淡黃褐色，口感清爽微酸。相比自然發(fā)酵酵素動輒以月、年為單位的長周期，以天為單位的控制發(fā)酵是具有一定可行性的，能極大降低工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中時(shí)間成本和貯存壓力。