郭晶斐，賀霞霞，涂 建，毛曉楠，周健康，陳宇釩，張麗珍，張國華

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

酸面團又稱酵子、酵頭、面肥等，是一種以乳酸菌和酵母菌為主要菌群的發(fā)酵劑[1]。舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是傳統(tǒng)老面中主要的優(yōu)勢菌[2-3]。舊金山乳桿菌具有最高的氨肽酶、二肽酶和三肽酶活性、兩種肽轉運系統(tǒng)（寡肽轉運蛋白（oligopeptide per mease，Opp）和細菌二/三肽轉運蛋白（Di-and tripeptide permease T，DtpT））及相關的五種胞內肽酶[4]，對發(fā)酵食品的營養(yǎng)及風味具有重要作用[5]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是傳統(tǒng)老面中兼性異型發(fā)酵的優(yōu)勢乳酸菌，廣泛存在于各類發(fā)酵食品中[6]。

小麥面團中的蛋白質以醇溶蛋白和麥谷蛋白為主，可與水作用形成具有黏彈性的網(wǎng)狀結構的面筋蛋白[7]，醇溶蛋白決定面團的延伸性，而麥谷蛋白決定面團的彈性及抗延伸性[8]。二硫鍵使麥谷蛋白常相互聚合為聚合體蛋白，即麥谷蛋白大聚體（glutenin macropolymer，GMP），在面筋的形成過程中起著骨架的作用，其含量和粒度分布對面團性質和面包加工及品質評價具有重要作用[9]。有研究表明，菌株發(fā)酵會影響麥谷蛋白溶解率、二硫鍵及二級結構的變化[10]，劉效謙等[11]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)老面發(fā)酵會使GMP分子中的游離巰基含量增加；GOBBETTI M等[12]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)溶于乙醇的黑麥多肽幾乎全被乳酸菌水解，顯著降低面包中的麩質蛋白含量[13]，降低小麥的致敏性[14]。目前，僅針對麥谷蛋白的部分理化性質（溶解率、游離巰基含量、二級結構）進行研究，未涉及其他更多的理化性質，也未涉及酸面團應用到實際發(fā)酵制品的研究。

本研究以分離自我國傳統(tǒng)酸面團中的優(yōu)勢菌種植物乳桿菌Sx9、舊金山乳桿菌Gm4和釀酒酵母Sq7，通過發(fā)酵麥谷蛋白大聚體溶液，測定麥谷蛋白大聚體的溶解性、游離巰基含量及二級結構的變化，以期進一步闡釋麥谷蛋白在乳酸菌與酵母菌發(fā)酵過程中的結構變化，為低麩質谷物食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

五得利金特精高筋小麥粉：五得利面粉集團；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Sx9、舊金山乳桿菌（Lacto bacillus sanfranciscensis）Gm4、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sq7：分離自酸面團，保存于實驗室。

1.1.2 試劑

硫酸銅、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市天宇化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：南京化學試劑股份有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津金匯太亞化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（分析純）：上海市華美生物工程公司；石油醚（分析純）：天津市天力化學用品有限公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市凱通化學試劑公司；氯化鉀（分析純）：上海藍擊生物科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白（純度＞98%）：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[15]：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸粉4 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二甲2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L，瓊脂粉15 g/L，pH 6.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

修正MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉10 g/L，麥芽糖20 g/L，酵母浸粉5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二甲2 g/L，檸檬酸銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L，pH 5.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[16]：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH 6.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

L400-P3真空抽濾機：美國圣斯特公司；LGJ-18真空冷凍干燥機：上海利聞科學儀器有限公司；GTR16-2低溫高速離心機：北京時代北利離心機有限公司；Vortex-Genie 2渦旋儀：美國Scientific Industries公司；LY01-3厭氧培養(yǎng)箱：上海龍躍儀器設備有限公司；UV-2600A紫外可見光分光光度計：尤尼柯（上海）有限公司；HRSP-H生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；傅立葉紅外變換光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀：北京北分瑞利分析儀器有限公司；ELITE 300 PLUS電泳儀：英國威泰克集團公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥谷蛋白大聚體的制備

面筋蛋白的制備：稱取面粉400 g，量取純凈水200 mL，室溫條件下，用25 ℃水和面，反復清洗面團，直至洗面后的水不渾濁，留下的黃色固體即為面筋蛋白。將面筋蛋白放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h至恒質量，得到的固體再粉碎處理，粉碎后過100目篩，備用。

面筋蛋白的脫脂：將面筋蛋白放入磨口錐形瓶中，加入適量石油醚，攪拌1 h，溶解其中脂質，過濾，反復操作兩次，石油醚濾液澄清則是脫脂終點標志。最后將過濾到的固體放置通風櫥中通風30 min，每15 min攪拌一次，使殘留的石油醚完全揮發(fā)。

麥谷蛋白大聚體的提取：將脫脂的面筋蛋白與1.5%的十二烷基硫酸鈉溶液以質量體積比1∶17的比例混合，攪拌1 h，25 ℃、10 000 r/min條件下離心30 min，去離心后的凝膠層真空冷凍干燥，再將冷凍干燥后的固體磨成粉，過100目篩，備用。

1.3.2 麥谷蛋白大聚體的發(fā)酵

將菌株Sx9、Gm4、Sq7分別接種于修正MRS、MRS、YPD液體培養(yǎng)基，分別在32 ℃、32 ℃、30 ℃條件下活化培養(yǎng)48 h。將活化的菌株以2%（V/V）的接種量分別接種至修正MRS、MRS、YPD液體培養(yǎng)基，分別在32 ℃、32 ℃、30 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h。25 ℃、3 000 r/min條件下離心，去上清，采用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次，懸浮于無菌PBS中，調整乳酸菌菌液菌體密度和酵母菌菌液菌體密度分別為109CFU/mL和107CFU/mL。

將麥谷蛋白大聚體粉末加入3種菌的菌液中，并控制每份蛋白質質量濃度均為10 mg/mL，攪拌至蛋白質在菌液中分散均勻，避免結塊。將處理好的菌液蛋白質混合物放置對應菌種適宜發(fā)酵條件下培養(yǎng)24 h，每隔6 h取樣20 mL冷凍干燥、研磨處理，測定可溶性蛋白質含量、游離巰基含量、蛋白質二級結構。

1.3.3 指標檢測方法

蛋白質溶解率的測定：以牛血清蛋白質質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（OD540nm值）（y）為縱坐標，繪制得到牛血清蛋白質標準曲線的回歸方程：y=0.058 1x+0.004 8（R2=0.997 7），采用雙縮脲法測定可溶性蛋白質含量，根據(jù)每份樣品液初始蛋白質質量濃度均為10mg/mL，得蛋白質溶解率[17]。

游離巰基含量的測定：以谷胱甘肽含量（x）為橫坐標，吸光度值（OD410nm值）（y）為縱坐標，繪制得到谷胱甘肽標準曲線的回歸方程：y=43.837x-0.033 6（R2=0.998 5），采用5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）法測定游離巰基含量[18-19]。

蛋白質二級結構的測定：采用傅立葉變換紅外光譜法測定蛋白質二級結構[20]。

蛋白質分子質量的測定：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析蛋白質分子質量[21]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復三次，結果用“平均值±標準差”表示，使用Origin 9.0處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0進行顯著性分析；使用PeakFitv4.1.2軟件處理紅外圖譜[22]。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中麥谷蛋白大聚體溶解率的變化

發(fā)酵過程中麥谷蛋白大聚體溶解率的變化見圖1。由圖1可知，在發(fā)酵0～12 h內，菌株Sq7和Sx9對麥谷蛋白大聚體的溶解率均呈上升趨勢，且菌株Sx9對麥谷蛋白大聚體的溶解率高于菌株Sq7，只有菌株Gm4對麥谷蛋白大聚體的溶解率呈現(xiàn)下降趨勢。在發(fā)酵12～18 h內，3株菌株對麥谷蛋白大聚體的溶解率均呈下降趨勢。在發(fā)酵18～24 h內，3株菌株對麥谷蛋白大聚體的溶解率均又呈上升趨勢，且菌株Gm4上升幅度最大，這可能是因為菌株Gm4主要以肽代謝為主，0～18 h內，溶液中麥谷蛋白大聚體的分子質量太大，舊金山乳桿菌對其雖有一定的降解能力，但是不是很明顯，到了18 h以后，溶液中肽含量增多，菌株Gm4代謝速度加快，蛋白質溶解率也迅速上升[23]?？偟膩碚f，通過菌株Gm4、Sx9和Sq7發(fā)酵24 h，麥谷蛋白大聚體的溶解率分別提高2.47%、7.06%、2.47%，說明植物乳桿菌Sx9對麥谷蛋白大聚體的溶解率最高，分析原因可能是釀酒酵母Sq7的產酸能力遠不及乳酸菌的產酸能力強，且舊金山乳桿菌Gm4對蛋白質的代謝能力較弱，主要以肽代謝為主[24]。

圖1 不同菌株發(fā)酵麥谷蛋白大聚體過程中麥谷蛋白大聚體溶解性的變化Fig.1 Changes of glutenin macropolymer solubility during the fermentation by different strains

2.2 發(fā)酵過程中游離巰基含量的變化

發(fā)酵過程中游離巰基含量的變化見圖2。由圖2可知，在發(fā)酵0～6 h內，菌株Gm4和Sq7發(fā)酵麥谷蛋白大聚體后，游離巰基含量呈上升趨勢，而菌株Sx9發(fā)酵后，游離巰基含量呈下降趨勢。在6～12 h內，菌株Sx9發(fā)酵麥谷蛋白大聚體后，游離巰基含量大幅度上升，而菌株Gm4發(fā)酵后，游離巰基含量下降。在發(fā)酵12～24 h內，菌株Sx9發(fā)酵麥谷蛋白大聚體后，游離巰基含量先減小后增加，而菌株Gm4發(fā)酵后，游離巰基含量一直呈現(xiàn)小幅度上升。在發(fā)酵6～18 h內，菌株Sq7發(fā)酵麥谷蛋白大聚體后，游離巰基含量大幅度下降，在發(fā)酵18～24 h內又有所上升?？傮w來說，菌株Sx9引起的變化趨勢和菌株Gm4、Sq7引起的變化趨勢恰好相反，這說明菌株Sx9在發(fā)酵初期更傾向促進游離巰基合成二硫鍵，增強麥谷蛋白大聚體的聚合度，菌株Gm4、Sq7則更傾向于破壞二硫鍵形成游離巰基，降低麥谷蛋白大聚體的聚合度。經與圖1對比分析，菌株Sx9在發(fā)酵0～6 h內游離巰基含量下降可能是因為植物乳桿菌在體內合成某些蛋白酶，合成蛋白酶的過程需要消耗游離硫元素，相應的導致游離巰基含量下降。在發(fā)酵6～12 h內，游離巰基含量上升是因為已合成的蛋白酶起到了水解麥谷蛋白大聚體的作用，進而增加了游離巰基的含量，此過程與圖1中用菌株Sx9發(fā)酵6～12 h內蛋白質溶解率增加相對應。由游離巰基含量的變化整體可知，經過24 h的發(fā)酵，菌株Sx9的發(fā)酵液中游離巰基含量（0.56 μmol/mg）比菌株Gm4（0.35 μmol/mg）和Sq7的發(fā)酵液（0.47 μmol/mg）中游離巰基含量高，與圖1中菌株Sx9對麥谷蛋白大聚體具有較好溶解效果一致?？傊S著發(fā)酵的進行，植物乳桿菌Sx9對于麥谷蛋白大聚體的降解效果更好。

圖2 不同菌株發(fā)酵麥谷蛋白大聚體過程中游離巰基含量的變化Fig.2 Changes of free sulfhydryl content during glutenin macropolymer fermentation by different strains

2.3 發(fā)酵過程中麥谷蛋白大聚體二級結構的變化

使用PeakFit 4.1.2軟件對紅外光譜的酰胺I帶進行了擬合，根據(jù)文獻[25-26]確定各子代譜峰，其中波數(shù)1 610～1 640 cm-1被指認為β-折疊、波數(shù)1 640～1 650 cm-1被指認為無規(guī)則卷曲、波數(shù)1 650～1 660 cm-1被指認為α-螺旋、波數(shù)1 660～1 700 cm-1被指認為β-轉角。不同菌株發(fā)酵后麥谷蛋白大聚體溶液中二級結構的含量見表1。

表1 不同菌株發(fā)酵后麥谷蛋白大聚體溶液中二級結構的含量Table 1 Contents of secondary structure in glutenin macropolymer solution after the fermentation by different strains

由表1可知，麥谷蛋白大聚體存在3種二級結構，分別是無規(guī)則卷曲、β-折疊和β-轉角。未經發(fā)酵過的麥谷蛋白大聚體無規(guī)則卷曲含量占50.17%，β-折疊占21.34%，β-轉角占28.49%。經過菌株Gm4發(fā)酵6 h后，無規(guī)則卷曲含量幾乎為零，全部轉化為β-折疊和β-轉角，β-折疊的數(shù)量略高于β-轉角，發(fā)酵直至24 h，β-折疊和β-轉角之間幾乎沒有轉換。經過菌株Sx9發(fā)酵6 h后，同菌株Gm4發(fā)酵6 h相同，幾乎所有的無規(guī)則卷曲轉化成β-折疊和β-轉角，且β-轉角的含量略低于β-折疊的含量，但發(fā)酵6～24 h內，β-轉角不斷向β-折疊轉化，最后β-折疊占60.54%，β-轉角占39.46%。經過菌株Sq7發(fā)酵6 h后，有極少量的無規(guī)則卷曲轉化為β-轉角，發(fā)酵6～24 h內，無規(guī)則卷曲、β-折疊和β-轉角含量又幾乎沒有發(fā)生變化，和發(fā)酵前組成相似。綜上，釀酒酵母Sq7對麥谷蛋白二級結構各部分含量幾乎沒有影響，舊金山乳桿菌Gm4和植物乳桿菌Sx9發(fā)酵24 h均明顯改變了二級結構各部分的含量，但植物乳桿菌Sx9發(fā)酵24 h后β-折疊的含量高于β-轉角的含量21.08%。經分析，造成此差異的原因可能仍和菌種的產酸能力有關，釀酒酵母Sq7的產酸能力弱，因此對麥谷蛋白的影響較弱，未能使不穩(wěn)定的無規(guī)則卷曲向穩(wěn)定的β-折疊和β-轉角直接轉變[27]。同時，乳酸菌產酸使pH降低更加適應乳酸菌生存，乳酸菌蛋白酶活性增強，更易降解麥谷蛋白大聚體[28]。酸性條件下，無規(guī)則卷曲向β-折疊和β-轉角轉化也使得蛋白質伸展，與微生物的接觸面積增大[29-30]，同時起到一個良性循環(huán)。

2.4 不同發(fā)酵時間段麥谷蛋白分子質量的變化

不同發(fā)酵時間段麥谷蛋白分子質量的變化見圖3。由圖3可知，植物乳桿菌Sx9發(fā)酵后麥谷蛋白大聚體的SDS-PAGE條帶顏色隨著發(fā)酵時間的延長逐漸變淺；舊金山乳桿菌Gm4發(fā)酵6～12 h使10～50 kDa區(qū)間的麥谷蛋白降解，但發(fā)酵18 h時，條帶顏色又明顯加深，發(fā)酵24 h條帶顏色又變淺，與舊金山乳桿菌Gm4經發(fā)酵出現(xiàn)的游離巰基含量反復上升下降現(xiàn)象相應，可能是乳酸菌代謝作用激發(fā)了面團中谷物蛋白酶的活性，使可溶性麥谷蛋白發(fā)生了部分降解，但此代謝作用微弱[31-32]。而釀酒酵母Sq7的麥谷蛋白的低分子質量區(qū)間的電泳條帶顏色隨著發(fā)酵基本保持不變，條帶沒有消失，也未產生新條帶；而高分子質量蛋白有微弱降解，分析原因可能是酵母菌在發(fā)酵過程中產生CO2，膨脹壓力使面筋延展，面筋不斷發(fā)生結合和切斷[32]，且發(fā)酵作用的基質僅有麥谷蛋白大聚體，提供的營養(yǎng)條件有限，經過長時間的發(fā)酵，釀酒酵母的作用略顯微弱。

圖3 植物乳桿菌Sx9、舊金山乳桿菌Gm4及釀酒酵母Sq7發(fā)酵后麥谷蛋白大聚體的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of glutenin macropolymer after the fermentation by Lactobacillus plantarum Sx9, Lactobacillus sanfranciscensis Gm4 and Saccharomyces cerevisiae Sq7

釀酒酵母Sq7、舊金山乳桿菌Gm4發(fā)酵麥谷蛋白大聚體的結果，與其對蛋白質溶解率及游離巰基含量作用微弱相似，經過發(fā)酵，釀酒酵母Sq7對麥谷蛋白大聚體的二級結構幾乎沒有作用，但植物乳桿菌Sx9對麥谷蛋白具有較好的降解作用，這可能是發(fā)酵過程中，微生物的代謝作用和產生的有機酸、乳酸、植物酸等使發(fā)酵環(huán)境的pH變低，改變了蛋白的疏水性，激發(fā)了蛋白酶活性[11]，內源蛋白酶催化面粉中組分的生化轉化[33]，從而降解了麥谷蛋白大聚體；再者，酸面團中乳酸菌的存在增加了異型微生物菌群的代謝活力[34]；此外，發(fā)酵過程中淀粉、植物酸等的降解也會對麥谷蛋白的溶解度產生影響，進而對食品質量與食品特殊功能產生影響[35]。

3 結論

傳統(tǒng)酸面團中的優(yōu)勢菌舊金山乳桿菌Gm4、植物乳桿菌Sx9、釀酒酵母Sq7都可以對麥谷蛋白起到一定的降解作用。在降解麥谷蛋白大聚體生成可溶性蛋白和游離巰基兩方面，植物乳桿菌Sx9表現(xiàn)均為最優(yōu)，發(fā)酵24 h蛋白質溶解率可達19.37%，分解生成游離巰基含量可達0.56 μmol/mg。在對二級結構的影響上，乳酸菌Gm4和Sx9表現(xiàn)優(yōu)于酵母菌Sq7，這源于乳酸菌的代謝產物催化促進了蛋白質二級結構的轉化。所以相比于釀酒酵母，乳酸菌對于麥谷蛋白大聚體有較好的降解作用，而植物乳桿菌又優(yōu)于舊金山乳桿菌。