董 蘊，張苗苗，鄧子文，劇 檸，郭 壯，趙慧君

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

發(fā)酵豆制品是以各種豆類為原料，在開放環(huán)境中經(jīng)自然發(fā)酵而形成特色風味的發(fā)酵成品[1]。醬豆作為我國主要的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，在發(fā)酵的過程中受微生物作用產(chǎn)生獨特的風味，發(fā)酵后的豆制品營養(yǎng)豐富，容易被人體消化吸收[2-4]。在我國，醬豆的食用歷史比較悠久，深受廣大消費者的喜愛，其作為發(fā)酵豆制品具有抑制腫瘤生長、降血壓、降血脂、延緩衰老和抗氧化等功效[4-6]。由于醬豆相對開放的發(fā)酵環(huán)境，導(dǎo)致其在發(fā)酵過程中的微生物菌群組成豐富且較為復(fù)雜，由于醬豆中所含的微生物對產(chǎn)品的風味造成影響，因此對醬豆中的微生物進行解析顯得尤為重要。JUNG J Y等[7]利用焦磷酸測序技術(shù)研究韓國發(fā)酵豆醬中醬醅的微生物動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆醬中醬醅的優(yōu)勢細菌和真菌分別為芽孢桿菌（Bacillus）和毛霉（Mucor）；張穎等[8]利用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）結(jié)合高通量測序技術(shù)對東北傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬發(fā)酵過程中的細菌多樣性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵階段豆醬的優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leukonostoc）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）；安飛宇等[9]對發(fā)酵豆醬的微生物多樣性進行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豆醬中的優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬和四聯(lián)球菌屬，優(yōu)勢真菌屬為青霉菌屬（Penicillium）和異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。

高通量測序技術(shù)是分析食品中微生物多樣性的方法之一，其通量高，測序結(jié)果準確，能夠產(chǎn)生大量的有用信息[10-12]。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學[13-14]、植物[15-16]以及食品[17-19]等諸多領(lǐng)域，其中在分析食品中微生物的多樣性研究中應(yīng)用尤為廣泛。高世南等[20]采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對新疆新源縣酸馬奶的細菌多樣性進行了解析，結(jié)果顯示酸馬奶中的優(yōu)勢細菌門主要為厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢細菌屬主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

本研究以湖北省恩施土家族苗族自治州利川市的醬豆為研究對象，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對其中的真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行解析，以期為后續(xù)醬豆的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市集市上10個不同攤位的醬豆樣品，樣品編號依次為LCJM1、LCJM2、LCJM3、LCJM4、LCJM5、LCJM6、LCJM7、LCJM8、LCJM9和LCJM10。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy maricon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；FastPfuFlyDNAPolymerase、5×TransStartTM、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；111860瓊脂糖：香港基因有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 利川醬豆樣品基因組的提取

使用QIAGEN DNeasy maricon Food Kit DNA基因組提取試劑盒提取利川醬豆樣品的基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將符合要求的DNA條帶置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序

以基因組DNA為模板，參考王丹丹等[21]的方法進行真菌18S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTP Mix 2 μL，正向引物SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'，加入7個核苷酸通用標簽）0.8 μL，反向引物SSU1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，檢測合格后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 利川醬豆樣品生物信息學分析

將測序后的序列拼接后，進一步按照WANG Y Y等[22]的方法進行質(zhì)控后篩選出優(yōu)化序列。使用QIIME（v1.7.0）對樣品進行生物物種分析[23]；使用軟件PyNAST[24]對齊序列后，用軟件UCLUST[25]以97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）；使用SILVA數(shù)據(jù)庫[26]在每個OTU中挑選一個代表性序列進行樣品的真菌分類信息分析。

1.3.4 多元統(tǒng)計學分析

使用R（v4.0.3）軟件繪制瀑布圖及相關(guān)性熱圖；使用軟件Origin 8.5繪制OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計圖、稀釋曲線圖、香農(nóng)指數(shù)曲線圖和柱狀堆積圖；使用Excel 2019繪制餅圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 利川醬豆樣品真菌菌群多樣性分析

2.1.1 利川醬豆樣品真菌菌群測序結(jié)果分析

對利川醬豆樣品進行高通量測序后，由測序結(jié)果可知，10個利川醬豆樣品經(jīng)序列比對后成功得到365 351條序列，其中樣品LCJM1、LCJM2、LCJM3、LCJM4、LCJM5、LCJM6、LCJM7、LCJM8、LCJM9和LCJM10的序列總數(shù)分別為33 171條、40 474條、38 331條、44 969條、37 239條、33 051條、34 578條、36 619條、30 287條和36 632條。為評估樣品的測序量是否足夠，繪制利川醬豆樣品的稀釋曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 利川醬豆樣品的稀釋曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Dilution curves (A) and Shannon index curves (B) of Lichuan Jiangdou samples

由圖1A可知，10個利川醬豆樣品中發(fā)現(xiàn)物種數(shù)隨著序列數(shù)的增加而增加，說明新的種系型可能會隨著序列數(shù)的增加而被發(fā)現(xiàn)。由圖1B可知，10個利川醬豆樣品的香農(nóng)指數(shù)隨著序列數(shù)的增加逐漸趨于平緩，說明隨著序列數(shù)的增加樣品中的多樣性不會再有變化，樣品的測序深度已足夠。由此可知，樣品的測序量能夠滿足要求，可進一步進行生物信息學分析。

2.1.2 利川醬豆樣品真菌OTU分析

將醬豆樣品中相對含量≥1%的OTU定義為核心OTU。OTU數(shù)量可反應(yīng)出樣品中微生物的豐度[27]，本研究對樣品OTU水平上的真菌微生物進行多樣性分析，結(jié)果見圖2。

圖2 利川醬豆樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計結(jié)果Fig.2 Statistical result of OTU occurrence times in Lichuan Jiangdou samples

由圖2可知，10個利川醬豆樣品中共產(chǎn)生5 391個真菌OTU，其中有18個OTU在10個樣品中均出現(xiàn)，占OTU總數(shù)的0.33%，但這些OTU中所包含的序列條數(shù)為210 186條，占測序序列總數(shù)的57.53%；而利川醬豆樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU有3 466個，占OTU總數(shù)的64.29%，但其包含的序列數(shù)為4 238條，僅占序列總數(shù)的1.16%。由此說明不同的利川醬豆樣品中有大量的共有真菌群落，盡管不同的醬豆樣品擁有大量的獨有菌群，但這部分微生物所占比例很低。為研究利川醬豆樣品中核心真菌群落組成及各自所占比例，本研究進一步對核心OTU的構(gòu)成和相對含量進行了解析，其分析結(jié)果見圖3。

圖3 核心OTU的構(gòu)成及相對含量分析結(jié)果Fig.3 Result of composition and relative content analysis of core OTU

由圖3可知，在10個利川醬豆樣品中的核心OTU共有5個，這些OTU占OTU總數(shù)的0.09%，但其所包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的54.19%，分別為OTU4582（4.00%）、OTU4725（15.09%）、OTU4078（1.51%）、OTU1212（2.65%）和OTU1121（30.93%）。其中OTU1121隸屬于畢赤酵母屬（Pichia），OTU4582隸屬于德巴利氏酵母屬（Debaryomyces），OTU4078、OTU4725和OTU1212隸屬于曲霉屬（Aspergillus）。由此可見，Pichia、Debaryomyces和Aspergillus為利川醬豆中的優(yōu)勢真菌。

2.2 利川醬豆樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

由利川醬豆樣品的物種注釋結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品中的真菌被鑒定為3個門、15個綱、27個目、34個科、45個屬。本研究將樣品中相對含量＜1.0%的細菌門或?qū)贇w為其他類（others），平均相對含量≥1.0%的細菌門或?qū)俣x為核心細菌門或?qū)??；陂T水平對利川醬豆樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于門水平利川醬豆樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of fungal flora structure of Lichuan Jiangdou samples based on phylum level

由圖4可知，10個利川醬豆樣品中被鑒定出的真菌門有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和毛霉亞門（Mucoromycotina），其平均相對含量分別為96.79%、2.63%和0.02%，其中Ascomycota和Basidiomycota為核心真菌門（平均相對含量≥1%），毛霉亞門（Mucoromycotina）只在樣品LCJM1、LCJM3、LCJM5和LCJM6中存在，且平均相對含量低，分別為0.006%、0.02%、0.16%和0.16%。進一步基于屬水平對利川醬豆樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，10個利川醬豆樣品中的核心真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉屬（Aspergillus）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母屬（Candida）、Starmerella、節(jié)擔菌屬（Wallemia）和鐮刀菌屬（Fusarium），其平均相對含量分別為37.46%、29.48%、3.92%、2.86%、2.62%、2.19%和1.03%。通過進一步分析核心真菌屬在不同樣品中的分布，發(fā)現(xiàn)Starmerella未在樣品LCMJ4中鑒定出，Wallemia未在樣品LCMJ5中鑒定出，而Pichia、Aspergillus、Debaryomyces、Candida和Fusarium在10個利川醬豆樣品中均存在。除此之外，還有15.72%的真菌序列未鑒定到屬水平，因此，利川醬豆樣品中的真菌資源仍有待發(fā)掘。

圖5 基于屬水平利川醬豆樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of fungal flora structure of Lichuan Jiangdou samples based on genus level

畢赤酵母屬（Pichia）作為利川醬豆樣品中的優(yōu)勢真菌屬，研究發(fā)現(xiàn)，其為非釀酒酵母且在自然界中分布較為廣泛，因其獨特的生理特性，可作為一種拮抗微生物而應(yīng)用到生物防治中[28]；德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）能夠通過代謝乳糖、蛋白質(zhì)和乳酸鹽而產(chǎn)生香味，同時也會產(chǎn)生一些有助于人體消化的小分子物質(zhì)[29]；曲霉屬（Aspergillus）作為利川醬豆的優(yōu)勢真菌屬，是一類絲狀真菌，在自然界中分布廣泛，其代謝的產(chǎn)物（多糖類、蒽醌類和生物堿類等）具有抗病毒、抗菌、抗氧化和抗癌等功能，且其廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中，如醬油、醋等[30-31]；由于利川醬豆發(fā)酵的開放環(huán)境，導(dǎo)致了醬豆在發(fā)酵過程中微生物的多樣性，因此在發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生一些不利于人體健康的真菌屬，如鐮刀菌屬（Fusarium），該菌屬可侵染植物造成植物的腐爛從而導(dǎo)致減產(chǎn)，有些鐮刀菌屬（Fusarium）可產(chǎn)生真菌毒素，食用后會造成食物中毒[32]。

2.3 核心真菌群落間的相關(guān)性分析

微生物彼此間相關(guān)關(guān)系的解析對于醬豆制品后續(xù)的標準化生產(chǎn)和品質(zhì)控制必不可少，為進一步確定利川醬豆樣品中核心真菌群落之間的相關(guān)性，本研究對醬豆樣品的核心真菌屬間及核心OTU間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果見圖6。

圖6 核真菌屬間（A）和核心OTU間（B）相關(guān)性分析結(jié)果Fig.6 Results of correlation analysis between core fungi (A) and core OTUs (B)

由圖6可知，在利川醬豆樣品的核心真菌屬之間，其相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）；核心OTU之間的相關(guān)性也均不顯著（P＞0.05）。由此可知，核心真菌群落間相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

采用Illumina MiSeq高通量測序?qū)ㄡu豆樣品真菌多樣性進行解析，結(jié)果顯示，利川醬豆樣品中的真菌菌群隸屬于3個門、15個綱、27個目、34個科、45個屬，核心真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（96.79%）和擔子菌門（Basidiomycota）（2.63%）；核心真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）（37.46%）、曲霉屬（Aspergillus）（29.48%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（3.92%）、假絲酵母屬（Candida）（2.86%）、Starmerella（2.62%）、節(jié)擔菌屬（Wallemia）（2.19%）和鐮刀菌屬（Fusarium）（1.03%），且核心真菌之間的相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。