劉延波，王琳琳，金尚萍，韓素娜，王 賢，孫西玉，張立新，潘春梅

（1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；3.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河南 三門峽 472400；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；6.賒店老酒股份有限公司，河南 南陽(yáng) 473300；7.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 商丘 476733）

大曲是以小麥（或配有大麥、豌豆）為主要原料，自然接種網(wǎng)羅環(huán)境微生物，在人工控制的溫度和濕度下培育而成[1]。大曲作為富含多酶多菌的微生物發(fā)酵制劑，在白酒的釀造過程中起著糖化、生香、發(fā)酵、提供菌源的作用，故釀酒行業(yè)素有“曲為酒之骨”之說[2-3]。

大曲中含有大量的微生物，主要包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌，是白酒發(fā)酵生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵基礎(chǔ)微生物[4]。霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，能夠分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)產(chǎn)生種類眾多的芳香類物質(zhì)[5]，為后續(xù)酒體風(fēng)味的形成奠定基礎(chǔ)[6]；酵母菌主要包括產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)酯酵母，產(chǎn)酒酵母多屬于釀酒酵母屬，主要影響產(chǎn)酒率，為白酒發(fā)酵提供動(dòng)力[7]，產(chǎn)酯酵母具有產(chǎn)酯能力，能夠增加酒體的酯含量，賦予酒舒適的香氣[8-9]。細(xì)菌種類繁多，補(bǔ)充并豐富了霉菌的酶系，是產(chǎn)生有機(jī)酸、酯類、酮類等風(fēng)味物質(zhì)和酚、黃酮等功能活性物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者[5]。不同的微生物各司其職，對(duì)白酒的釀造也起著不同的作用。

近年來，關(guān)于微生物群落多樣性的研究很多，大多采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）克隆文庫(kù)，其中利用傳統(tǒng)方法分離到的微生物在種類和數(shù)量上有限[10]；PCR-DGGE、DNA克隆文庫(kù)等方法存在測(cè)序量有限、工作量大、靈敏度不高，且僅對(duì)群落中主要成分比較敏感等缺陷[11]，而高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序時(shí)間短、測(cè)序通量高的優(yōu)勢(shì)，為準(zhǔn)確揭示微生物菌群的多樣性提供了強(qiáng)有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[12]，因此，已被廣泛用于分析釀酒微生物的群落組成[13-14]。

培養(yǎng)成熟的新鮮大曲需經(jīng)一段時(shí)間的儲(chǔ)存才能投入使用[15]，儲(chǔ)存期間發(fā)生多種生化反應(yīng)，使得微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)、酶系結(jié)構(gòu)、物系結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生重大變化，是重要的后熟過程[16]。適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存對(duì)于大曲的質(zhì)量提升有著極其重要的作用[17]；但儲(chǔ)存期過長(zhǎng)，容易導(dǎo)致曲蟲危害，增加損耗和庫(kù)存成本[18-19]。在實(shí)際生產(chǎn)中，大曲儲(chǔ)存時(shí)間都是憑借經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行操作的，具有一定風(fēng)險(xiǎn)。目前，對(duì)于大曲不同儲(chǔ)藏期的微生物多樣性研究較少，因此，本研究利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏期賒店老酒大曲的微生物群落多樣性進(jìn)行分析，解析儲(chǔ)藏過程中不同微生物的群落組成及差異，完善濃香型白酒大曲微生物數(shù)據(jù)庫(kù)，為改善大曲儲(chǔ)藏時(shí)間以提高后續(xù)白酒釀造工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：河南賒店老酒股份有限公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil：美國(guó)MP Biomedicals公司；產(chǎn)物回收試劑盒：天根生化科技有限公司；Trans DNA 15Kmarker、DNA聚合酶AP221-02：北京全式金生物技術(shù)公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合液、真菌擴(kuò)增引物SSU0817F和1196R、細(xì)菌擴(kuò)增引物338F和806R：美吉生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Julabo TW12恒溫水浴鍋：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；Nano Drop 2000紫外可見分光光度計(jì)、ST16R高速冷凍離心機(jī)、PICO17小型臺(tái)式離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；GeneAmp 9700型PCR儀：美國(guó)ABI公司；Quanti Fluor-ST DNA定量?jī)x：美國(guó)Promega公司；Illumina Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

3月齡（A）、6月齡（B）、9月齡（C）三個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)期的大曲分別按堆垛層的上中下取3個(gè)平行樣本進(jìn)行五點(diǎn)取樣，粉碎混勻后，做好標(biāo)記，用無菌袋密封-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大曲微生物總DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)Fast DNA SPIN Kit for Soil說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

以提取的總DNA為模板，采用SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）、1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）為引物對(duì)真菌的18S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物對(duì)細(xì)菌的V3～V4可變區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系均為：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，正向引物（5μmol/L）0.8μL，反向引物（5μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)合格后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。

1.3.3 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

文庫(kù)的建立和高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用Flash軟件進(jìn)行拼接；使用的Uparse軟件，根據(jù)序列相似度＞97%進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[20]聚類；使用Uchime軟件剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%?；贠TU聚類分析，通過Mothur（v1.30.2）軟件計(jì)算每個(gè)樣品的α多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao 1指數(shù)等反映酒曲樣品中的微生物菌群的豐富度和多樣性[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲高通量測(cè)序及α多樣性分析結(jié)果

Illumina Miseq高通量測(cè)序結(jié)果通過質(zhì)控和過濾后得到優(yōu)質(zhì)序列，根據(jù)序列相似度＞97%聚類得到OTU數(shù)，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果見表1。

表1 濃香型白酒大曲高通量測(cè)序及α多樣性分析結(jié)果Table 1 Results of high-throughput sequencing and α diversity analysis of strong-flavor Baijiu Daqu

由表1可知，從3個(gè)大曲樣品共獲得細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列172385條，平均堿基長(zhǎng)度為443 bp；共獲得真菌優(yōu)質(zhì)序列110 385條，平均堿基長(zhǎng)度為401 bp。將所有序列按照97%的相似性進(jìn)行OTU聚類分析，在聚類過程中去除嵌合體，共得到了605個(gè)細(xì)菌OTU和26個(gè)真菌OTU。儲(chǔ)藏期不同，OTU數(shù)目也有所不同。α多樣性分析是用來表征某個(gè)特殊區(qū)域或者生態(tài)環(huán)境中的物種多樣性，常包括香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)和超1（Chao 1）指數(shù)等[20]。其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高，Chao 1指數(shù)常用來估計(jì)物種總數(shù)，其值越大，物種豐富度越高，而Simpson指數(shù)值越大，其物種多樣性越低[21]。由表1亦可知，6月齡大曲樣品的Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)均達(dá)到最大值，而Simpson指數(shù)處于最小值，說明6月齡大曲樣品的群落多樣性和物種豐富度最高。為考察本次試驗(yàn)取樣及測(cè)序深度合理，繪制濃香型白酒大曲樣品細(xì)菌及真菌微生物的Shannon指數(shù)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 濃香型白酒大曲樣品的Shannon指數(shù)曲線Fig.1 Shannon index curve of strong-flavor Baijiu Daqu samples

由圖1可知，各個(gè)樣品隨著測(cè)序數(shù)量的增加，其Shannon指數(shù)稀釋曲線趨于平坦，且表1中的Coverage指數(shù)均＞0.99，由此可知本次試驗(yàn)取樣及測(cè)序深度合理，結(jié)果能夠代表所有樣本微生物的真實(shí)菌群情況。

2.2 OTU分布的Venn圖

Venn圖可以用來統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)樣本在OTU水平上的組成相似性及重疊性，不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品OTU的Venn圖見圖2。

圖2 不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品OTU的Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU of strong-flavor Baijiu Daqu samples in different storage periods

由圖2可知，從3個(gè)大曲樣品中共獲得605個(gè)細(xì)菌，其中共有的OTU數(shù)目為58個(gè)，占OTU總數(shù)的9.5%，3月齡與6月齡獨(dú)有的OTU數(shù)目均接近其總OTU半數(shù)，而9月齡獨(dú)有的OTU數(shù)目較少；共獲得26個(gè)真菌OTU，其中共有的OTU數(shù)目為14個(gè)，占OTU總數(shù)的54%，即所代表的真菌物種長(zhǎng)期存在于不同儲(chǔ)藏期的大曲中。通過Venn圖可以看出，不同儲(chǔ)藏期的大曲所含有的微生物種類存在差異性。

2.3 不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于門水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖3。

圖3 基于門水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品細(xì)菌及真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Analysis result of bacteria and fungi community structure in strong-flavor Baijiu Daqu samples at different storage periods based on phylum level

由圖3可知，在門水平上細(xì)菌門主要有厚壁菌門（Fimicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），其中3月齡大曲樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（相對(duì)豐度＞1%）有厚壁菌門（62.66%）、變形菌門（27.15%）；6月齡大曲樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有厚壁菌門（63.53%）、變形菌門（15.26%）、擬桿菌門（14.87%）；9月齡大曲樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有變形菌門（80.86%）和厚壁菌門（17.39%）；變形菌門在大曲儲(chǔ)存過程中相對(duì)豐度先下降后上升，在后期達(dá)到絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在門水平上，3月齡、6月齡、9月齡大曲樣品的優(yōu)勢(shì)真菌門（相對(duì)豐度＞1%）均為子囊菌門（Ascomycota），且3個(gè)樣品中子囊菌門比例均達(dá)到99%。

2.3.2 基于屬水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在屬水平上3月齡大曲樣品所含優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞1%）有10個(gè)，分別為乳球菌屬（Lactococcus）（27.90%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（23.14%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（14.81%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（7.12%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（2.32%）、片球菌屬（Pediococcus）（1.97%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（1.61%）、norank_c_Cyanobacteria（1.48%）、腸球菌屬（Enterococcus）（1.48%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（1.00%）。6月齡大曲樣品所含優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有8個(gè)，分別為unclassified_f_Peptostreptococcaceae（24.64%）、Escherichia-Shigella（11.80%）、土孢桿菌屬（Terrisporobacter）（6.47%）、Clostridium_sensu_stricto_1（5.68%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（4.61%）、norank_f_Bac teroidales_S24-7_group（3.65%）、Ruminococcaceae_UCG-005（2.88%）、Rikenellaceae_RC9_gut_group（2.63%）。9月齡大曲樣品所含優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有4個(gè)，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）（79.80%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（6.32%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（4.59%）、片球菌屬（Pediococcus）（1.59%）。土孢桿菌屬、Clostridiumsensu stricto 1、Ruminococcaceae UCG-005只在6月齡大曲中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，在3月齡和9月齡大曲中為非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。

圖4 基于屬水平不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品細(xì)菌及真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of bacteria and fungi community structure in strong-flavor Baijiu Daqu samples at different storage periods based on genus level

從不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，3月齡和9月齡大曲樣品在屬水平上絕大多數(shù)為產(chǎn)乳酸的菌屬，如乳酸桿菌、乳酸球菌、魏斯氏菌屬和腸桿菌屬，此類菌屬在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸與乙醇被酯化形成乳酸乙酯，但乳酸乙酯含量過多會(huì)造成酒體香味不協(xié)調(diào)[15-16]，6月齡大曲獨(dú)有的菌屬Terrisporobacter、Clostridium_sensu_stricto_1、Ruminococcaceae_UCG-005為己酸菌，己酸菌的代謝產(chǎn)物己酸乙酯是構(gòu)成濃香型白酒的主體香味物質(zhì)。3月齡大曲中的乳酸桿菌、乳酸球菌、魏斯氏菌屬均屬于乳酸菌[17]。在白酒釀造過程中，乳酸菌可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，過量乳酸會(huì)造成白酒口感酸澀，影響酒質(zhì)，且在酸性環(huán)境易形成生物胺[18]，人體攝入過量的生物胺會(huì)對(duì)機(jī)體造成不良反應(yīng)[19]。6月齡大曲樣品中的Clostridium_sensu_stricto_1屬于梭菌綱，梭菌綱微生物是濃香型白酒釀造中主要的己酸菌[20]；Terrisporobacter、Ruminococcaceae_UCG-005也是能產(chǎn)己酸的己酸菌[15]。9月齡大曲樣品中的腸桿菌屬可發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸[21]，且也是大曲中可產(chǎn)生物胺的細(xì)菌[22]。

由圖4亦可知，在屬水平上3個(gè)大曲樣品中共檢測(cè)出6個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%），分別為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、耐堿酵母屬（Galactomyces）、Arachniotus。3月齡大曲樣品含有5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，分別為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（51.18%）、畢赤酵母屬（Pichia）（22.14%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（17.79%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（5.33%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（2.54%）；6月齡大曲樣品所含優(yōu)勢(shì)菌屬類型與3月齡大曲樣品相同，但占比不同，即復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（34.27%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（30.27%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（17.80%）、畢赤酵母屬（Pichia）（15.70%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（1.06%）；9月齡大曲樣品含有6個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，分別為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（67.94%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoas cus）（15.69%）、畢赤酵母屬（Pichia）（7.30%）、曲霉菌屬（As pergillus）（4.91%）、Arachniotus（1.67%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（1.16%）。

從不同儲(chǔ)藏期濃香型白酒大曲樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)分析，3、6、9月齡大曲樣品的真菌群落組成相差不大，但組成比例差異明顯，6月齡大曲的嗜熱子囊菌屬和曲霉菌屬占比均高于其他月齡的大曲。曲霉菌屬能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶、果膠酶、纖維素酶和單寧酶，在白酒的釀造過程中主要作用于發(fā)酵的前期，是白酒發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質(zhì)的主要?jiǎng)恿χ唬瑸榘l(fā)酵持續(xù)進(jìn)行和風(fēng)味物質(zhì)形成發(fā)揮著重要作用[23]。嗜熱子囊菌屬具有良好的酶分泌特性，產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶類，并具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠在白酒發(fā)酵過程中溫度較高的條件下保持穩(wěn)定的催化效率[24]，在后續(xù)的堆積糖化發(fā)酵以及對(duì)風(fēng)味的形成起著重要的作用[5]，有利于大曲產(chǎn)酒生香。畢赤酵母屬具有較強(qiáng)產(chǎn)酯功能，能夠利用發(fā)酵環(huán)境中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[25]，生成大量酯類風(fēng)味物質(zhì)，是白酒釀造中一類重要的功能微生物[26]。復(fù)膜孢酵母屬能夠分泌淀粉酶在內(nèi)的多種水解酶[27]，是成品曲中酶類的重要產(chǎn)生菌，同時(shí)具有較好的產(chǎn)酒和產(chǎn)酯能力[28]。

隨著大曲儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅會(huì)影響多種微生物的相對(duì)豐度及產(chǎn)酶特性，還會(huì)增加庫(kù)存成本，故從微生物的富集、平衡角度及菌屬特性分析，建議儲(chǔ)存期為6個(gè)月的濃香型大曲更適合投入后續(xù)白酒釀造生產(chǎn)。梁麗文等[18]選取白云邊酒不同儲(chǔ)存期的高溫大曲為研究對(duì)象，從微生物數(shù)量、細(xì)菌種類、發(fā)酵力和糖化力等方面的變化規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果表明大曲儲(chǔ)存6月為宜；梁晨等[29]利用高通量測(cè)序剖析0～6月份大曲成熟過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分的變化規(guī)律，得到大曲貯存4～6個(gè)月更有利于白酒的釀造；劉雪等[17]通過研究濃香型中高溫大曲的理化指標(biāo)和微生物種類及數(shù)量隨儲(chǔ)存期延長(zhǎng)的變化規(guī)律，得出大曲要儲(chǔ)存3～5個(gè)月方能投入生產(chǎn)。本研究結(jié)果與以上研究基本一致。

此外，本研究首次從濃香型白酒大曲中檢測(cè)出的菌屬有耐堿酵母屬、Arachniotus、norank_c_Cyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢桿菌屬、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group、Ruminococcaceae_UCG-005、Rikenellaceae_RC9_gut_group。HU Z等[30]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析青貯玉米秸稈，在屬水平上檢測(cè)出norank_c_Cyanobacteria；戴奕杰等[31]在醬香型白酒大曲檢測(cè)到Escherichia-Shigella等為優(yōu)勢(shì)菌屬；栗連會(huì)等[32]在瀘型酒酒醅中發(fā)現(xiàn)土孢桿菌屬；LI T等[33]利用高通量測(cè)序技術(shù)在小鼠腸道中檢測(cè)到norank_f_Bacteroidales_S24-7_group；BAY V等[34]利用高通量測(cè)序技術(shù)在奶牛爪角中檢測(cè)到Ruminococcaceae_UCG-005和Rikenellaceae_RC9_gut_group這兩種微生物。部分菌屬已證實(shí)存在于釀酒過程中，但其生長(zhǎng)機(jī)制與代謝機(jī)制的研究仍然滯后，在濃香型白酒釀造中，上述菌屬的功能仍有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏期賒店老酒濃香型白酒大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，從3個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)期大曲樣品中共發(fā)現(xiàn)26個(gè)細(xì)菌屬和13個(gè)真菌屬，其中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳球菌屬（Lactococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）；共有的優(yōu)勢(shì)真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、耐堿酵母屬（Galactomyces）；不同儲(chǔ)存期大曲樣品群落組成相似，但其優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度差異明顯。從微生物的菌屬特性、平衡角度分析，儲(chǔ)存期為6月的大曲更適合投入白酒生產(chǎn)。

此外，首次從濃香型白酒大曲中發(fā)現(xiàn)耐堿酵母屬、Arachniotus、norankcCyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢桿菌屬、norank f Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcaceae UCG-005和Rikenellaceae RC9 gut group。進(jìn)一步揭示了大曲儲(chǔ)存過程中微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化，在此基礎(chǔ)上建議了大曲的最佳儲(chǔ)存時(shí)間，對(duì)后續(xù)大曲出庫(kù)投入白酒釀造的合理儲(chǔ)存時(shí)間具有一定的科學(xué)指導(dǎo)意義，有利于大曲質(zhì)量的提高。