馬 宏， 吳 宇， 陳晉瑩， 古艷婷， 李 麗，胡 莎， 張震昊， 葉 金， 王松雪

(新疆維吾爾自治區(qū)糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站1，烏魯木齊 830000)(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院2，北京 102629)(中儲糧成都儲藏研究院有限公司3，成都 610000)(北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司4，北京 100176)(青島市糧油質(zhì)量檢測和軍隊(duì)糧油供應(yīng)中心5，青島 266042)

有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[1]是目前最常用的農(nóng)藥之一，廣泛用于糧食作物的生產(chǎn)和儲藏中，過量殘留在糧食作物上的農(nóng)藥可經(jīng)消化道、呼吸道及完整的皮膚和黏膜進(jìn)入人體，對人體造成不同程度的損害，影響人們的健康。近年來，糧食作物中因?yàn)檗r(nóng)藥殘留超標(biāo)的報(bào)道時(shí)有發(fā)生。因此，建立糧食中農(nóng)藥殘留檢測方法，對于加強(qiáng)糧食質(zhì)量安全水平，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥種類多，化學(xué)性質(zhì)差異大，因此檢測難度較大，常用的檢測方法包括高精密儀器分析方法和快速檢測方法。現(xiàn)有的高精密儀器分析方法主要有液相色譜[2-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[7-15]、氣相色譜[16-19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[20-26]等，雖然色譜類方法使農(nóng)藥殘留分析從一種或幾種農(nóng)藥發(fā)展到可同時(shí)測定幾十種至上百種不同種類的農(nóng)藥，實(shí)現(xiàn)了對農(nóng)藥的高通量，高靈敏度的定性、定量檢測、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，但由于需要大型的色譜、質(zhì)譜設(shè)備，檢測成本高，同時(shí)對操作人員技術(shù)水平要求高，適合國家及省級檢測站使用，限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室及收購現(xiàn)場的應(yīng)用?？焖贆z測方法由于具有操作簡便，檢測時(shí)間短，成本低，無需大型儀器等優(yōu)勢，適合于現(xiàn)場的快速篩查。目前的快速檢測方法主要包括化學(xué)速測法[27]、免疫分析法[28, 29]、酶抑制法[30-33]和生物熒光法[34]等?；瘜W(xué)速測法主要根據(jù)氧化還原反應(yīng)，水解產(chǎn)物與檢測液作用變色，常用于有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測，但是化學(xué)速測法靈敏度低，使用有局限性，且易受還原性物質(zhì)干擾，因此應(yīng)用較少；免疫分析法最常用的是酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)，以抗原與抗體的特異性、結(jié)合反應(yīng)的可逆性為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，靈敏度高、選擇性好，但通常只能檢測一種農(nóng)藥，無法進(jìn)行多殘留檢測；而酶抑制法是在基于農(nóng)藥能抑制動植物體內(nèi)某些特定的生物酶活性，通過肉眼或儀器觀察顯色反應(yīng)，從而對樣品中的農(nóng)殘進(jìn)行定性檢測，因具有快速、操作簡便、成本低廉等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但是傳統(tǒng)的酶抑制法采用的是乙酰膽堿酯酶，此方法靈敏度較低，許多目標(biāo)物的靈敏度無法滿足國家限量要求。

本研究采用經(jīng)過改良的昆蟲酯酶，其與農(nóng)藥殘留的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的乙酰膽堿酯酶，并且底物經(jīng)過修飾，增加了酶與底物的特異性結(jié)合能力；同時(shí)用高靈敏的熒光底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的顯色底物，進(jìn)一步提高了方法的靈敏度，可同時(shí)檢測有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物，樣品處理簡單，無需純化，谷物糧食只需簡單提取，檢測速度快，可在20 min內(nèi)完成多個(gè)樣品的檢測，另外，實(shí)驗(yàn)過程無需標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)對實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平要求低，因此，既適用于糧油收儲單位和糧油加工企業(yè)進(jìn)行糧食收儲驗(yàn)質(zhì)，同時(shí)適用于糧油質(zhì)量監(jiān)測機(jī)構(gòu)進(jìn)行糧食質(zhì)量監(jiān)管，大大提高檢測效率，降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Novalum-Ⅱ生物熒光檢測儀，INC-220-LUM孵育器，渦旋振蕩器，離心機(jī)；丙酮、乙酸乙酯(色譜純)；無水硫酸鈉；昆蟲酯酶、熒光素酶受體；敵敵畏、對硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷、殺螟硫磷、甲拌磷、樂果、毒死蜱、馬拉硫磷；玉米全粉空白(有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類)、小麥全粉空白(有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類)、稻谷全粉空白(有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類)。

1.2 儀器條件

生物熒光檢測儀條件：PMT熒光信號采集器，激發(fā)波長：460～550 nm，發(fā)射波長590 nm；孵育器：溫度≥35 ℃。

1.3 樣品前處理方法

稱取0.5 g(精確至0.01 g)樣品于10 mL的離心管中，加入2 mL 20%無水硫酸鈉溶液，再加入2 mL乙酸乙酯-丙酮(95∶5)溶液，混勻。在4 500 r/min下離心2 min，取100 μL上清液至2 mL離心管中，在45 ℃下用吹至近干。加入1 mL 水復(fù)溶，此溶液為待測溶液。

1.4 樣品測定

準(zhǔn)確移取100 μL待測溶液加入到檢測微管中，然后加入50 μL昆蟲酯酶溶液，混勻。將微管置于35 ℃的孵育器中孵育10 min。接著向檢測微管底部加入50 μL酶受體溶液，混勻。將微管置于35 ℃的孵育器中，孵育5 min。向檢測微管加入1 mL熒光底物溶液，用生物熒光檢測儀讀取檢測結(jié)果。

1.5 限量酶抑制率計(jì)算和結(jié)果判定

以GB 2763—2019[35]食品中農(nóng)藥最大殘留限量為基礎(chǔ)，進(jìn)行空白基質(zhì)限量濃度加標(biāo)，測試3 d，每天測試6個(gè)平行樣品，合計(jì)18個(gè)樣品計(jì)算方法的平均酶抑制率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)理論中一尾檢驗(yàn)(one-tailed test)原理，當(dāng)a=0.05時(shí)，18個(gè)平行樣品結(jié)果統(tǒng)計(jì)的t值為1.74，得到限量酶抑制率計(jì)算公式為：

yMRL=(ym-1.74S)×100

式中：yMRL為限量酶抑制率/%；ym為空白基質(zhì)限量濃度加標(biāo)的抑制率平均值；S為標(biāo)準(zhǔn)偏差。

當(dāng)檢測結(jié)果低于限量酶抑制率時(shí)，樣品符合要求，即為陰性。當(dāng)結(jié)果高于限量酶抑制率，樣品為疑似不符合，即疑似陽性，需使用儀器方法復(fù)檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

測定樣品提取液與酶溶液反應(yīng)時(shí)間對酶抑制率的影響，熒光素底物溶液和熒光素酶溶液的體積為50 μL，反應(yīng)溫度為35 ℃，考察了3、5、8、10、13、15 min等不同反應(yīng)時(shí)間下酶抑制率情況反應(yīng)時(shí)間在10 min內(nèi)時(shí)隨著時(shí)間的延長，酶抑制率會增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10 min后，酶抑制率隨著時(shí)間的延長沒有明顯的增加，因此選擇10 min作為樣品提取液與酶溶液的最佳反應(yīng)時(shí)間。

本方法可同時(shí)處理7份糧食樣品，樣品稱量、提取、離心、氮吹、復(fù)溶等前處理時(shí)間約20 min，提取液與酶溶液的反應(yīng)時(shí)間為10 min，熒光素酶受體反應(yīng)時(shí)間為5 min，即樣品檢測時(shí)間為15 min。因此整個(gè)方法同時(shí)處理7份糧食樣品所需時(shí)間約為35 min，平均每份樣品5 min。

2.2 反應(yīng)溫度對酶抑制率的影響

測定樣品提取液與酶溶液反應(yīng)溫度對酶抑制率的影響，熒光素底物溶液和熒光素酶溶液的體積為50 μL，考察了25、30、35、40、45 ℃等不同反應(yīng)溫度，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，昆蟲酯酶抑制率會增加，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃后，昆蟲酯酶的抑制率達(dá)到最大，隨著溫度繼續(xù)升高昆蟲酯酶的抑制率會明顯下降，因此選擇35 ℃作為樣品提取液與酶溶液的最佳反應(yīng)溫度。

2.3 判定方法確定

糧食及其制品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯農(nóng)藥種類高達(dá)150種，為了便于快速篩查，目前傳統(tǒng)的酶抑制法規(guī)定的判定方法均基于一個(gè)固定值進(jìn)行判定，如GB/T 5009.199—2003[36]的判定方法是根據(jù)抑制率是否大于50%來判斷，當(dāng)抑制率大于50%時(shí)，結(jié)果為陽性，小于50%時(shí)，結(jié)果為陰性。但由于有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留種類多，限量濃度相差大，相同農(nóng)藥不同品種樣品間的限量濃度也可能不同，這些因素都會導(dǎo)致農(nóng)藥的陽性抑制率不在50%左右。 因此，按照GB/T 5009.199—2003中單一的使用抑制率50%作為結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，必然導(dǎo)致方法篩查的準(zhǔn)確性降低。

表1為部分常見農(nóng)藥在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)限量濃度下的抑制率，可以看出，多數(shù)農(nóng)藥限量濃度抑制率不在50%，直接采用50%抑制率進(jìn)行判定，容易產(chǎn)生較高的假陽性率和假陰性率，導(dǎo)致篩查的結(jié)果不準(zhǔn)確。

表1 部分常見農(nóng)殘的限量濃度時(shí)的酶抑制率

對于農(nóng)殘的快速篩查方法而言，主要為了判定結(jié)果是否超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量濃度。因此本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)用性考慮，以GB 2763—2019限量濃度下農(nóng)藥的酶抑制率進(jìn)行判定。通過比較樣品和目標(biāo)農(nóng)藥殘留限量濃度的酶抑制率大小進(jìn)行結(jié)果判定，當(dāng)樣品抑制率高于目標(biāo)農(nóng)藥殘留限量濃度的酶抑制率時(shí)，表示樣品中可能有高劑量該類目標(biāo)有機(jī)磷類或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留存在，樣品判定為疑似陽性樣品，對疑似陽性樣品，需用參考方法進(jìn)一步復(fù)檢，確定具體農(nóng)藥的種類和含量。當(dāng)樣品的抑制率低于判定抑制率，表示樣品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留較低，該樣品判定為陰性樣品。同時(shí)報(bào)告時(shí)應(yīng)標(biāo)明對何種目標(biāo)農(nóng)藥殘留呈疑似陽性或陰性。

2.3.1 選擇目標(biāo)農(nóng)藥種類

為了確認(rèn)本方法的適用性，對不同類型的用戶對于農(nóng)藥快速檢測需求進(jìn)行摸底調(diào)研。包括大型農(nóng)場主，糧食加工企業(yè)，糧油質(zhì)檢站和食藥部門等不同行業(yè)的用戶，調(diào)研結(jié)果如表2所示。

表2 農(nóng)藥快檢需求調(diào)研

大部分的用戶使用過程中都有一個(gè)目標(biāo)農(nóng)藥列表，且農(nóng)殘數(shù)量不超過5～10種。因此為了提高方法篩查的準(zhǔn)確性，可以利用現(xiàn)有已知條件，盡量減少目標(biāo)物范圍，提高判定結(jié)果準(zhǔn)確度。根據(jù)檢測農(nóng)藥列表、樣品基質(zhì)種類，可以有效排除一大批該基質(zhì)種類無限量要求的農(nóng)藥，根據(jù)樣品的來源及產(chǎn)地農(nóng)殘監(jiān)測情況和施藥指南情況，可以進(jìn)一步降低目標(biāo)農(nóng)藥種類，縮小到盡量少的范圍內(nèi)，確定可能的目標(biāo)農(nóng)藥種類，提高方法的準(zhǔn)確性。根據(jù)確定的目標(biāo)農(nóng)藥，選取其中最低的限量抑制率作為判定抑制率，可以盡量減少假陰性的發(fā)生，提高快速的篩查的準(zhǔn)確性。

2.3.2 限量酶抑制率

農(nóng)藥的限量酶抑制率是本方法判定的基準(zhǔn)，確定限量濃度下該農(nóng)藥對酶抑制率對于結(jié)果的判定十分關(guān)鍵。通過查閱和調(diào)研國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，歐盟法規(guī)Commission Regulation (EU) No 519/2014[37]規(guī)定了針對快速篩查方法的結(jié)果判定方法。利用檢測結(jié)果與判定值比較進(jìn)行結(jié)果的判定，當(dāng)檢測結(jié)果低于判定值時(shí)，樣品符合要求，即為陰性。當(dāng)結(jié)果高于判定值，樣品為疑似不符合，即疑似陽性，需使用儀器方法復(fù)檢。其中判定值的獲得非常關(guān)鍵，歐盟法規(guī)中給出了具體的計(jì)算方法。根據(jù)篩查的目標(biāo)濃度，針對不同的種類，分別進(jìn)行該濃度下的檢測結(jié)果平均值RSTC及標(biāo)準(zhǔn)偏差SDSTC，利用統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)理論中一尾檢驗(yàn)原理，計(jì)算95%的概率時(shí)的值作為判定值，確保判定結(jié)果正確率大于95%。

2.3.3 5種農(nóng)藥酶限量抑制率

實(shí)驗(yàn)選擇5種常用農(nóng)藥敵敵畏、對硫磷、甲萘威、克百威和辛硫磷，通過比較2種不同判定方法結(jié)果的準(zhǔn)確性情況，以0.5倍、1倍、2倍限量濃度3種濃度空白糙米樣品加標(biāo)，判定結(jié)果數(shù)和方法假陰性率，假陽性率和正確率，結(jié)果如表3所示。

表3 判定結(jié)果

其中判定一按照本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的判定方法(見1.5 限量酶抑制率計(jì)算和結(jié)果判定)，以限量酶抑制率為判定基準(zhǔn)，判定二根據(jù)GB/T 5009.199—2003規(guī)定，以抑制率50%為判定基準(zhǔn)。由于GB/T 5009.199—2003的判定為單一的評價(jià)方式(根據(jù)抑制率為50%判斷)，對于限量抑制率不在50%附近的農(nóng)藥而言，其準(zhǔn)確性較差，如甲萘威(限量抑制率為65.08%)，辛硫磷(限量抑制率為40.62%)的正確率只有63%和33%。本實(shí)驗(yàn)中利用限量抑制率判定，可以準(zhǔn)確得到各個(gè)農(nóng)藥的限量抑制率，利用其真實(shí)的限量抑制率而不是通用的抑制率50%進(jìn)行判定，使得單個(gè)農(nóng)藥的判定假陽性率，假陰性率都有顯著的降低，正確率從原來的33%～78%提升至74%～94%，顯著提高了方法的準(zhǔn)確性。

2.4 方法的檢出限

本方法的檢出限匯總見表4。通過空白基質(zhì)加標(biāo)樣品逐級稀釋得到信噪比的3倍作為檢出限，可以滿足糧食中有機(jī)磷和氨基甲酸酯限量檢測的要求。

表4 本方法檢出限匯總

表5 實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果

2.5 方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性，選擇10個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表5。驗(yàn)證樣品包括空白玉米樣品，空白小麥樣品，空白稻谷樣品，加標(biāo)濃度水平為0.5倍、1倍、2倍限量濃度3個(gè)水平。對10個(gè)實(shí)驗(yàn)室返回的3 087個(gè)檢測結(jié)果根據(jù)GB/T 6379.2—2004[38]，采用柯克倫檢驗(yàn)和格拉布斯檢驗(yàn)剔除離群值。結(jié)果顯示，本次驗(yàn)證2倍限量濃度加標(biāo)水平樣品無假陰性發(fā)生，1倍限量濃度加標(biāo)水平樣品的假陰性率<5%，0.5倍限量濃度加標(biāo)水平樣品的假陽性率<30%，說明本方法在各實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)確性良好。重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr<10% 的占76.2%，RSDr<15% 的占95.2% ，說明本方法在各實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性良好。再現(xiàn)性RSDR<15% 的占66.7 %;RSDR<25% 的占95.2% ，說明本方法實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性良好。

2.6 方法實(shí)際應(yīng)用

為了更好地驗(yàn)證方法實(shí)際使用效果，收集2018年度某小麥主產(chǎn)區(qū)共58份小麥樣品。使用本方法進(jìn)行快速篩查，其中71%的樣品抑制率小于30%，91%樣品抑制率小于40%，使用儀器方法對所有樣品進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果顯示超標(biāo)樣品2份，均為辛硫磷超標(biāo)。表6為模擬不同的情況下本方法的判定結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)檢測目標(biāo)農(nóng)藥只有辛硫磷，該情況下的判定抑制率即為小麥辛硫磷限量抑制率，準(zhǔn)確率高達(dá)96.5%。當(dāng)檢測目標(biāo)農(nóng)藥為5種常見的農(nóng)藥(敵敵畏、對硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷)，選取其中最低限量抑制率，即敵敵畏的限量抑制率36.95%，以36.95%作為判定抑制率，最終準(zhǔn)確率為91.4%。當(dāng)檢測目標(biāo)農(nóng)藥為10種常見的農(nóng)藥(敵敵畏、對硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷、樂果、殺螟硫磷、甲拌磷、毒死蜱、馬拉硫磷)，選取其中最低限量抑制率為毒死蜱的32.56%，故以32.56%作為判定抑制率，最終準(zhǔn)確率為86.2%。這3種情況下，所有結(jié)果均無假陰性，且假陽性率較低，準(zhǔn)確率較高，說明本方法可以很好地用于基層現(xiàn)場農(nóng)藥殘留的快速篩查。

表6 不同情況下58份小麥樣品快檢結(jié)果準(zhǔn)確率

3 結(jié)論

本研究通過樣品提取液與酶溶液的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對酶抑制率的影響，確定了樣品提取液與酶溶液的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min，最佳反應(yīng)溫度為35 ℃。在此基礎(chǔ)上，確定限量酶抑制率為判定方法，即以GB 2763—2019限量濃度下農(nóng)藥的酶抑制率進(jìn)行判定。以敵敵畏、對硫磷、甲萘威、克百威和辛硫磷5種農(nóng)藥為例，通過限量酶抑制率和傳統(tǒng)50%抑制率2種判定方法進(jìn)行比較，限量酶抑制率判定方法可以使單個(gè)農(nóng)藥的假陽性率，假陰性率都有顯著的降低，方法的準(zhǔn)確性有顯著提高，從原來的33%～78%提升至74%～94%。同時(shí)本研究選擇了10家實(shí)驗(yàn)室對方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)際應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中，對58份樣品用本方法進(jìn)行篩查，同時(shí)用儀器方法進(jìn)行復(fù)檢，本方法檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。本方法操作簡單，檢測時(shí)間短，本方法形成糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 6139—2020 《糧油檢驗(yàn) 糧食及其制品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測》，可以很好地用于基層現(xiàn)場糧食中農(nóng)藥殘留的快速篩查。