陳金媛，范芳娟，靳夢楠，李 丁

（湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007）

當(dāng)前，工農(nóng)業(yè)技術(shù)越來越先進(jìn)，但技術(shù)發(fā)展的同時也帶來了許多負(fù)面影響。例如，越來越多的土壤受到重金屬等的污染，尤其是水稻農(nóng)田的重金屬污染問題引起了民眾的廣泛關(guān)注。水稻是我國大部分地區(qū)的主要糧食作物，土壤中的重金屬通過水稻制品進(jìn)入食物鏈，導(dǎo)致Cd、As 等重金屬大量在人體中積累，對人體健康造成極大危害。研究表明，人體Cd 中毒將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、癌癥[1]，As 中毒會誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、癌癥[2-3]等。因此，探究重金屬污染的水稻農(nóng)田修復(fù)以及安全利用具有重要的現(xiàn)實意義。

鐵錳膜（iron manganese plaque，IP）是附著在濕地植物根系表面的一層鐵錳氧化膠膜，具有阻隔植物吸收污染物的作用[4]。生長在淹水環(huán)境中的濕地植物向根際運輸并釋放氧氣，維持植物的正常呼吸，同時，多余的氧氣可將環(huán)境中的Fe2+和Mn2+氧化并沉淀為包裹根面的鐵錳斑，最終形成鐵錳膜[5]。由于具有吸附功能的基團(tuán)，鐵錳膜可以吸附或共沉淀金屬離子，并作為“屏障”減少植物對Pb、Cu、Ni、Hg 和Sb等金屬的吸收[6-7]，還可以改變植物體內(nèi)As、Cd 和Se 的轉(zhuǎn)運[8]。還有研究表明，因為對金屬離子具有較強(qiáng)的吸附性，鐵錳膜可用作緩沖劑，降低As 在水中的溶解度[9]。

鐵錳膜的形成受土壤理化性質(zhì)、水分管理、根際氧化物質(zhì)以及鐵錳氧化菌和鐵錳還原菌等[10-11]多種因素的影響。其中，鐵錳氧化菌是一類能夠促進(jìn)鐵、錳氧化形成鐵、錳氧化物的微生物。已有研究表明，鐵錳氧化菌能夠促進(jìn)植物根系鐵錳膜的形成。Providenciasp. LLDRA6 是一株分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊土壤的細(xì)菌，前期已通過基礎(chǔ)試驗證明菌株具有錳氧化能力和鐵氧化能力[12]。筆者擬通過水培試驗初步探究該菌株對鐵錳膜形成以及Cd 在水稻植株體中轉(zhuǎn)運的影響，為該菌株的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種供試菌株為土壤細(xì)菌Providenciasp.LLDRA6（CCTCC 保藏編號：M2018876），分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊的土壤，前期已通過基礎(chǔ)試驗證明菌株LLDRA6 具有錳氧化能力和鐵氧化能力。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）LB 培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，超純水1 000 mL，pH值 7.0（固體培養(yǎng)基加18.0 g 瓊脂）。（2）水稻營養(yǎng)液組分：NH4NO391.4 mg/L、NaH2PO4·2H2O 32.14 mg/L、K2SO471.4 mg/L、CaCl288.6 mg/L、MgSO4158.22 mg/L、MnCl2·4H2O 1.5 mg/L、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.074 mg/L、H3BO30.934 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.035 mg/L、CuSO4·5H2O 0.031 mg/L、FeCl34.62 mg/L、Citric acid monohydrate 11.9 mg/L。

1.1.3 供試水稻供試水稻品種為華占和臺北309，水稻種子來自湖南雜交水稻研究中心。種子消毒后催芽，選取長勢均勻的幼苗移栽。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配置（1）菌株懸浮液：將供試菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中于35℃的恒溫?fù)u床中180 r/min 培養(yǎng)16 h 后，6 000 r/min 離心10～15 min 收集菌體，并重懸于同等體積無菌去離子水中制成懸浮液備用。（2）DCB 提取液：稱取88.23 g Na3C6H5O7·2H2O 和10.48 g NaHCO3，去離子水充分溶解后，定容至1 L 容量瓶中，Na3C6H5O7·2H2O濃度為0.3 mol/L，NaHCO3濃度為0.125 mol/L。

1.2.2 試驗設(shè)計水稻發(fā)芽后，選取長勢均勻的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中（每盆1 L 營養(yǎng)液）。試驗設(shè)置5 個處理，每個處理3 個平行，分別為：處理1（CK），空白對照；處理2，菌株懸浮液+Fe2+（Fe2+濃度為5 mmol/L，菌株懸浮液添加量為30%）；處理3，H2O+Fe2+（Fe2+濃度為5 mmol/L）；處理4，菌株懸浮液+Mn2+（Mn2+濃度為1 mmol/L，菌株懸浮液添加量為30%）；處理5：H2O+Mn2+（Mn2+濃度為1 mmol/L）。每星期換2 次營養(yǎng)液，生長1 周后檢測根系DCB-Fe和DCB-Mn 含量；然后在營養(yǎng)液中添加Cd2+（Cd2+濃度1 mg/L），繼續(xù)生長1 周后，收集莖葉部分樣品進(jìn)行檢測。

1.2.3 DCB 法檢測根系鐵錳膜含量水稻根系表面鐵錳膜含量的檢測方法為DCB（dithionite-citratebicarbonate）提取法。隨機(jī)選取不同盆栽水稻根系，洗凈后自然晾干水分，置于盛有30 mL DCB 提取液和0.5 g 保險粉的錐形瓶中，室溫下浸提1 h。浸提液過0.25 μL 針孔式水系濾膜，濾液于4℃冰箱保存，F(xiàn)e、Mn含量采用原子火焰吸收儀測定。

1.2.4 酶活性的檢測方法與步驟：按所用試劑盒（POD、SOD）說明書進(jìn)行操作。具體內(nèi)容如下：將收集的新鮮水稻根系組織剪碎，稱量約0.1 g 放入玻璃勻漿器中，加入提取液1 mL，冰浴中進(jìn)行勻漿；待樣本完全研碎后，將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管；4℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，計算不同處理下水稻根系POD和SOD 酶活性。

1.2.5 莖葉部分鎘含量將所有水培水稻莖葉部位的樣品分別裝入紙袋，65℃下干燥72 h，烘干至恒重后研磨成粉，送湖南雜交水稻研究中心檢測樣品中的Cd 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003、Origin 8.5.0等進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對水培水稻根系外觀的影響

水稻種子消毒浸泡發(fā)芽，選取長勢均勻的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中適應(yīng)生長，1 周后進(jìn)行處理。處理后又生長了1 周的水稻根系如圖1 所示。經(jīng)懸浮液+Fe2+處理后，2 個水稻品種的根系均呈現(xiàn)明顯的紅色，且顏色比H2O+Fe2+處理組更深。由此推測，LLDRA6 菌株可能會促進(jìn)水稻根系表面形成較厚的鐵錳膜。

圖1 不同處理下水培水稻根系的外觀

2.2 不同處理對水稻根系POD 和SOD 酶活性的影響

由圖2 可知，臺北309 品種的根系POD 酶活性顯著高于華占的；2 個水稻品種處理2～5 的POD 酶活性高于處理1（CK）。華占品種中，處理2（懸浮液+Fe2+）和處理4（懸浮液+Mn2+）的POD 酶活性略高于其他處理組；臺北309 品種中，處理3（H2O+Fe2+）和處理4（懸浮液+Mn2+）的POD 酶活性顯著高于其他處理組。華占與臺北309的SOD酶活性無明顯差異，處理后的水稻根系SOD 酶活性顯著高于CK，且2 個品種均以處理3（H2O+Fe2+）的SOD 酶活性最高?？傮w來看，菌株懸浮液和Fe2+、Mn2+溶液處理，可以增高水稻根系的POD 酶和SOD 酶活性。由于SOD 酶可以清除植株的自由基，而POD 酶在植物的抗逆性中起重要作用。因此，上述溶液處理可以增強(qiáng)水稻的抗逆及防御系統(tǒng)，提高水稻對環(huán)境的適應(yīng)性。

圖2 不同處理下2 個品種水稻根系的POD 和SOD 酶活性

2.3 不同處理對水稻根系鐵錳膜含量的影響

由表1 可知，華占品種中，處理2 的DCB-Fe 含量最高，處理4 的DCB-Mn 和DCB-Cd 含量最高。臺北309 品種中，處理2～5 的DCB-Fe 含量均高于處理1（CK），其中處理2 的DCB-Fe 含量最高；處理5 的DCB-Mn 含量高于其他處理，處理4 次之；處理2 的DCB-Cd 含量高于其他處理。產(chǎn)生這樣結(jié)果的原因可能是鐵錳氧化菌LLDRA6 促進(jìn)了Fe2+、Mn2+氧化形成致密的鐵錳膜附著在根表面，而鐵錳膜上又吸附了大量的Cd 元素阻止Cd 元素繼續(xù)向水稻莖葉部分運輸。

表1 不同處理下2 個品種水稻根系表面的元素含量

2.4 不同處理對水稻莖葉部分鎘含量的影響

如圖3 所示，2 個水稻品種處理2～5 的莖葉部分Cd 含量均顯著低于處理1（CK）。其中，華占品種中，處理2 的Cd 含量最低，其次是處理3，二者的Cd 含量均遠(yuǎn)低于處理4～5；而臺北309 品種中，處理3 的鎘含量最低，其次是處理2，二者的Cd 含量均遠(yuǎn)低于處理4～5。由此推測，菌株LLDRA6 和Fe2+溶液誘導(dǎo)鐵錳膜形成的效果強(qiáng)于LLDRA6 和Mn2+溶液。然而，鐵錳膜的形成受諸多因素的影響，不同水稻品種間存在差異。

圖3 不同處理下2 個品種水稻莖葉部分的Cd 含量

3 結(jié)論與討論

在盆栽水培條件下，用鐵錳氧化菌菌懸液和Fe2+、Mn2+溶液處理水稻幼苗，1 周后，菌株懸浮液+Fe2+處理的2 個水稻品種的根系均呈現(xiàn)明顯的紅色，說明菌株LLDRA6 懸浮液可促進(jìn)水稻根系表面形成鐵膜；DCB 法結(jié)果也證實了這一點，菌株懸浮液+Fe2+處理的水稻根系表面DCB-Fe 含量顯著高于其他處理；根系酶活檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Fe2+和Mn2+處理后，水稻根系的POD 酶和SOD 酶的活性高于空白對照組；經(jīng)Fe2+處理后，2 個水稻品種莖葉部分的Cd 含量顯著低于其他處理組。由此推測，菌株LLDRA6 可促進(jìn)水稻根系表面鐵錳膜的形成，對Cd 在水稻植株中的遷移具有顯著的阻隔效果。

大米一直被認(rèn)為是人體Cd 攝入的主要途徑之一[13]。水稻根系表面鐵錳膜的形成主要受土壤氧化以及還原體系中Fe、Mn 在水稻根表的還原溶解和氧化成礦情況影響。錳在金屬從水稻土到植株根部的運輸中起著至關(guān)重要的作用[14]。然而，鐵錳膜的形成是一個動態(tài)的過程，在不同環(huán)境以及不同植物及其生長不同時期均有明顯的差異。此外，水稻對Cd 的吸收還受土壤中Cd 的有效性以及根際環(huán)境的影響。其中，Cd 的有效性主要由Cd2+的形態(tài)決定。而根際環(huán)境主要受根系生長的物理力、根系分泌物以及根際微生物的影響[15-16]。這可能是導(dǎo)致根際土壤中Cd 的流動性、生物有效性和歸趨獨特性的主要原因[17]。

目前，關(guān)于鐵錳膜對水稻吸收污染物影響的研究已有較多報道。例如，有研究稱，IP 對水生植物吸收和攝取抗生素的影響主要表現(xiàn)在其可以阻止抗生素在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運。Tang 等[18]的研究表明，四環(huán)素類藥物（TCs）在根面的吸附量與IP 量呈正相關(guān)，TCs 的轉(zhuǎn)運因子也與IP 含量呈良好的負(fù)線性關(guān)系。當(dāng)多環(huán)芳烴和多溴聯(lián)苯醚在淹水狀態(tài)下暴露于2 種紅樹植物的根部時，根部形成的IP 起到了“屏障”的作用，阻止了污染物進(jìn)入植物[19]。還有研究顯示，具有發(fā)達(dá)根系且能夠形成鐵錳膜的水生植物常用于修復(fù)受污染的水體。

筆者的研究證明了菌株LLDRA6 能夠促進(jìn)水稻根際表面鐵錳膜的形成，鐵錳膜又可以有效阻隔水稻對Cd 元素的吸收和轉(zhuǎn)運，同時可以通過增強(qiáng)POD 和SOD 酶活性來提高水稻的抗逆性。然而，該研究是基于溶液水平完成的，植株根系所處環(huán)境與真實的水稻生長環(huán)境有較大差異。因此，后續(xù)將開展土壤盆栽試驗以及大田試驗進(jìn)行進(jìn)一步驗證。