陳金媛,范芳娟,靳夢(mèng)楠,李 丁
(湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,湖南 株洲 412007)
當(dāng)前,工農(nóng)業(yè)技術(shù)越來(lái)越先進(jìn),但技術(shù)發(fā)展的同時(shí)也帶來(lái)了許多負(fù)面影響。例如,越來(lái)越多的土壤受到重金屬等的污染,尤其是水稻農(nóng)田的重金屬污染問(wèn)題引起了民眾的廣泛關(guān)注。水稻是我國(guó)大部分地區(qū)的主要糧食作物,土壤中的重金屬通過(guò)水稻制品進(jìn)入食物鏈,導(dǎo)致Cd、As 等重金屬大量在人體中積累,對(duì)人體健康造成極大危害。研究表明,人體Cd 中毒將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、癌癥[1],As 中毒會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、癌癥[2-3]等。因此,探究重金屬污染的水稻農(nóng)田修復(fù)以及安全利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
鐵錳膜(iron manganese plaque,IP)是附著在濕地植物根系表面的一層鐵錳氧化膠膜,具有阻隔植物吸收污染物的作用[4]。生長(zhǎng)在淹水環(huán)境中的濕地植物向根際運(yùn)輸并釋放氧氣,維持植物的正常呼吸,同時(shí),多余的氧氣可將環(huán)境中的Fe2+和Mn2+氧化并沉淀為包裹根面的鐵錳斑,最終形成鐵錳膜[5]。由于具有吸附功能的基團(tuán),鐵錳膜可以吸附或共沉淀金屬離子,并作為“屏障”減少植物對(duì)Pb、Cu、Ni、Hg 和Sb等金屬的吸收[6-7],還可以改變植物體內(nèi)As、Cd 和Se 的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。還有研究表明,因?yàn)閷?duì)金屬離子具有較強(qiáng)的吸附性,鐵錳膜可用作緩沖劑,降低As 在水中的溶解度[9]。
鐵錳膜的形成受土壤理化性質(zhì)、水分管理、根際氧化物質(zhì)以及鐵錳氧化菌和鐵錳還原菌等[10-11]多種因素的影響。其中,鐵錳氧化菌是一類能夠促進(jìn)鐵、錳氧化形成鐵、錳氧化物的微生物。已有研究表明,鐵錳氧化菌能夠促進(jìn)植物根系鐵錳膜的形成。Providenciasp. LLDRA6 是一株分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊土壤的細(xì)菌,前期已通過(guò)基礎(chǔ)試驗(yàn)證明菌株具有錳氧化能力和鐵氧化能力[12]。筆者擬通過(guò)水培試驗(yàn)初步探究該菌株對(duì)鐵錳膜形成以及Cd 在水稻植株體中轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,為該菌株的開發(fā)利用提供依據(jù)。
1.1.1 菌 種供試菌株為土壤細(xì)菌Providenciasp.LLDRA6(CCTCC 保藏編號(hào):M2018876),分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊的土壤,前期已通過(guò)基礎(chǔ)試驗(yàn)證明菌株LLDRA6 具有錳氧化能力和鐵氧化能力。
1.1.2 培養(yǎng)基(1)LB 培養(yǎng)基:酵母浸粉5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,氯化鈉5.0 g,超純水1 000 mL,pH值 7.0(固體培養(yǎng)基加18.0 g 瓊脂)。(2)水稻營(yíng)養(yǎng)液組分:NH4NO391.4 mg/L、NaH2PO4·2H2O 32.14 mg/L、K2SO471.4 mg/L、CaCl288.6 mg/L、MgSO4158.22 mg/L、MnCl2·4H2O 1.5 mg/L、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.074 mg/L、H3BO30.934 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.035 mg/L、CuSO4·5H2O 0.031 mg/L、FeCl34.62 mg/L、Citric acid monohydrate 11.9 mg/L。
1.1.3 供試水稻供試水稻品種為華占和臺(tái)北309,水稻種子來(lái)自湖南雜交水稻研究中心。種子消毒后催芽,選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗移栽。
1.2.1 溶液配置(1)菌株懸浮液:將供試菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中于35℃的恒溫?fù)u床中180 r/min 培養(yǎng)16 h 后,6 000 r/min 離心10~15 min 收集菌體,并重懸于同等體積無(wú)菌去離子水中制成懸浮液備用。(2)DCB 提取液:稱取88.23 g Na3C6H5O7·2H2O 和10.48 g NaHCO3,去離子水充分溶解后,定容至1 L 容量瓶中,Na3C6H5O7·2H2O濃度為0.3 mol/L,NaHCO3濃度為0.125 mol/L。
1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)水稻發(fā)芽后,選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的水稻幼苗,分栽至黑色避光水稻盆中(每盆1 L 營(yíng)養(yǎng)液)。試驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)處理,每個(gè)處理3 個(gè)平行,分別為:處理1(CK),空白對(duì)照;處理2,菌株懸浮液+Fe2+(Fe2+濃度為5 mmol/L,菌株懸浮液添加量為30%);處理3,H2O+Fe2+(Fe2+濃度為5 mmol/L);處理4,菌株懸浮液+Mn2+(Mn2+濃度為1 mmol/L,菌株懸浮液添加量為30%);處理5:H2O+Mn2+(Mn2+濃度為1 mmol/L)。每星期換2 次營(yíng)養(yǎng)液,生長(zhǎng)1 周后檢測(cè)根系DCB-Fe和DCB-Mn 含量;然后在營(yíng)養(yǎng)液中添加Cd2+(Cd2+濃度1 mg/L),繼續(xù)生長(zhǎng)1 周后,收集莖葉部分樣品進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.3 DCB 法檢測(cè)根系鐵錳膜含量水稻根系表面鐵錳膜含量的檢測(cè)方法為DCB(dithionite-citratebicarbonate)提取法。隨機(jī)選取不同盆栽水稻根系,洗凈后自然晾干水分,置于盛有30 mL DCB 提取液和0.5 g 保險(xiǎn)粉的錐形瓶中,室溫下浸提1 h。浸提液過(guò)0.25 μL 針孔式水系濾膜,濾液于4℃冰箱保存,F(xiàn)e、Mn含量采用原子火焰吸收儀測(cè)定。
1.2.4 酶活性的檢測(cè)方法與步驟:按所用試劑盒(POD、SOD)說(shuō)明書進(jìn)行操作。具體內(nèi)容如下:將收集的新鮮水稻根系組織剪碎,稱量約0.1 g 放入玻璃勻漿器中,加入提取液1 mL,冰浴中進(jìn)行勻漿;待樣本完全研碎后,將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管;4℃,12 000 r/min 離心10 min,收集上清液,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)操作,計(jì)算不同處理下水稻根系POD和SOD 酶活性。
1.2.5 莖葉部分鎘含量將所有水培水稻莖葉部位的樣品分別裝入紙袋,65℃下干燥72 h,烘干至恒重后研磨成粉,送湖南雜交水稻研究中心檢測(cè)樣品中的Cd 含量。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003、Origin 8.5.0等進(jìn)行處理分析。
水稻種子消毒浸泡發(fā)芽,選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的水稻幼苗,分栽至黑色避光水稻盆中適應(yīng)生長(zhǎng),1 周后進(jìn)行處理。處理后又生長(zhǎng)了1 周的水稻根系如圖1 所示。經(jīng)懸浮液+Fe2+處理后,2 個(gè)水稻品種的根系均呈現(xiàn)明顯的紅色,且顏色比H2O+Fe2+處理組更深。由此推測(cè),LLDRA6 菌株可能會(huì)促進(jìn)水稻根系表面形成較厚的鐵錳膜。
圖1 不同處理下水培水稻根系的外觀
由圖2 可知,臺(tái)北309 品種的根系POD 酶活性顯著高于華占的;2 個(gè)水稻品種處理2~5 的POD 酶活性高于處理1(CK)。華占品種中,處理2(懸浮液+Fe2+)和處理4(懸浮液+Mn2+)的POD 酶活性略高于其他處理組;臺(tái)北309 品種中,處理3(H2O+Fe2+)和處理4(懸浮液+Mn2+)的POD 酶活性顯著高于其他處理組。華占與臺(tái)北309的SOD酶活性無(wú)明顯差異,處理后的水稻根系SOD 酶活性顯著高于CK,且2 個(gè)品種均以處理3(H2O+Fe2+)的SOD 酶活性最高??傮w來(lái)看,菌株懸浮液和Fe2+、Mn2+溶液處理,可以增高水稻根系的POD 酶和SOD 酶活性。由于SOD 酶可以清除植株的自由基,而POD 酶在植物的抗逆性中起重要作用。因此,上述溶液處理可以增強(qiáng)水稻的抗逆及防御系統(tǒng),提高水稻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。
圖2 不同處理下2 個(gè)品種水稻根系的POD 和SOD 酶活性
由表1 可知,華占品種中,處理2 的DCB-Fe 含量最高,處理4 的DCB-Mn 和DCB-Cd 含量最高。臺(tái)北309 品種中,處理2~5 的DCB-Fe 含量均高于處理1(CK),其中處理2 的DCB-Fe 含量最高;處理5 的DCB-Mn 含量高于其他處理,處理4 次之;處理2 的DCB-Cd 含量高于其他處理。產(chǎn)生這樣結(jié)果的原因可能是鐵錳氧化菌LLDRA6 促進(jìn)了Fe2+、Mn2+氧化形成致密的鐵錳膜附著在根表面,而鐵錳膜上又吸附了大量的Cd 元素阻止Cd 元素繼續(xù)向水稻莖葉部分運(yùn)輸。
表1 不同處理下2 個(gè)品種水稻根系表面的元素含量
如圖3 所示,2 個(gè)水稻品種處理2~5 的莖葉部分Cd 含量均顯著低于處理1(CK)。其中,華占品種中,處理2 的Cd 含量最低,其次是處理3,二者的Cd 含量均遠(yuǎn)低于處理4~5;而臺(tái)北309 品種中,處理3 的鎘含量最低,其次是處理2,二者的Cd 含量均遠(yuǎn)低于處理4~5。由此推測(cè),菌株LLDRA6 和Fe2+溶液誘導(dǎo)鐵錳膜形成的效果強(qiáng)于LLDRA6 和Mn2+溶液。然而,鐵錳膜的形成受諸多因素的影響,不同水稻品種間存在差異。
圖3 不同處理下2 個(gè)品種水稻莖葉部分的Cd 含量
在盆栽水培條件下,用鐵錳氧化菌菌懸液和Fe2+、Mn2+溶液處理水稻幼苗,1 周后,菌株懸浮液+Fe2+處理的2 個(gè)水稻品種的根系均呈現(xiàn)明顯的紅色,說(shuō)明菌株LLDRA6 懸浮液可促進(jìn)水稻根系表面形成鐵膜;DCB 法結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),菌株懸浮液+Fe2+處理的水稻根系表面DCB-Fe 含量顯著高于其他處理;根系酶活檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)Fe2+和Mn2+處理后,水稻根系的POD 酶和SOD 酶的活性高于空白對(duì)照組;經(jīng)Fe2+處理后,2 個(gè)水稻品種莖葉部分的Cd 含量顯著低于其他處理組。由此推測(cè),菌株LLDRA6 可促進(jìn)水稻根系表面鐵錳膜的形成,對(duì)Cd 在水稻植株中的遷移具有顯著的阻隔效果。
大米一直被認(rèn)為是人體Cd 攝入的主要途徑之一[13]。水稻根系表面鐵錳膜的形成主要受土壤氧化以及還原體系中Fe、Mn 在水稻根表的還原溶解和氧化成礦情況影響。錳在金屬?gòu)乃就恋街仓旮康倪\(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用[14]。然而,鐵錳膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,在不同環(huán)境以及不同植物及其生長(zhǎng)不同時(shí)期均有明顯的差異。此外,水稻對(duì)Cd 的吸收還受土壤中Cd 的有效性以及根際環(huán)境的影響。其中,Cd 的有效性主要由Cd2+的形態(tài)決定。而根際環(huán)境主要受根系生長(zhǎng)的物理力、根系分泌物以及根際微生物的影響[15-16]。這可能是導(dǎo)致根際土壤中Cd 的流動(dòng)性、生物有效性和歸趨獨(dú)特性的主要原因[17]。
目前,關(guān)于鐵錳膜對(duì)水稻吸收污染物影響的研究已有較多報(bào)道。例如,有研究稱,IP 對(duì)水生植物吸收和攝取抗生素的影響主要表現(xiàn)在其可以阻止抗生素在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。Tang 等[18]的研究表明,四環(huán)素類藥物(TCs)在根面的吸附量與IP 量呈正相關(guān),TCs 的轉(zhuǎn)運(yùn)因子也與IP 含量呈良好的負(fù)線性關(guān)系。當(dāng)多環(huán)芳烴和多溴聯(lián)苯醚在淹水狀態(tài)下暴露于2 種紅樹植物的根部時(shí),根部形成的IP 起到了“屏障”的作用,阻止了污染物進(jìn)入植物[19]。還有研究顯示,具有發(fā)達(dá)根系且能夠形成鐵錳膜的水生植物常用于修復(fù)受污染的水體。
筆者的研究證明了菌株LLDRA6 能夠促進(jìn)水稻根際表面鐵錳膜的形成,鐵錳膜又可以有效阻隔水稻對(duì)Cd 元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)可以通過(guò)增強(qiáng)POD 和SOD 酶活性來(lái)提高水稻的抗逆性。然而,該研究是基于溶液水平完成的,植株根系所處環(huán)境與真實(shí)的水稻生長(zhǎng)環(huán)境有較大差異。因此,后續(xù)將開展土壤盆栽試驗(yàn)以及大田試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。