林放 周謀 李文丹 孫宇 駱美良 單桂秋

慢性難愈性創(chuàng)面主要包括壓瘡、糖尿病足潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍及下肢動(dòng)靜脈潰瘍，創(chuàng)面感染是慢性難愈性創(chuàng)面持久不愈的重要原因之一[1]。目前主要使用換藥、超聲波、高壓氧、局部灌洗等非手術(shù)治療方法，同時(shí)使用抗菌藥物進(jìn)行聯(lián)合治療[2]，但治療效果不如人意。因此，有必要尋找一種更加安全和有效的抑菌治療方法。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是繼富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）之后的第二代富血小板濃縮物，富含生長(zhǎng)因子、抗菌肽和纖維蛋白原等。PRF對(duì)單一菌的抑菌作用已被大家認(rèn)可，但對(duì)混合菌的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究PRF對(duì)金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合菌的體外抑菌效果，為下一步PRF治療合并感染的慢性難愈性創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料 大腸桿菌Escherichia coli（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC292-13）購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；氨芐西林購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； Luria-Bertani medium（LB）肉湯、LB瓊脂、tryptone soy broth（TSB）肉湯購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 儀器和試劑 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)BC-3000），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)HWS-250），厭氧罐（北京恒奧科技有限公司，型號(hào)AG015），掃描電鏡（德國(guó)蔡司，Zeiss Ultra 55），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)SW-CJ-1FD），高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5804）。

3 富血小板血漿的制備

3.1 用EDTA抗凝采血管分別采集4名志愿者靜脈血20 mL（每管10 mL），分別制備PRP；獻(xiàn)血者在實(shí)驗(yàn)前1個(gè)月內(nèi)未服用抗菌藥物；沒(méi)有接受抗凝或免疫抑制治療；抽血前簽署知情同意書(shū)。

3.2 用離心機(jī)使用富漿法分離血小板，第一次510 g離心10 min。離心結(jié)束后，在超凈臺(tái)內(nèi)分離紅細(xì)胞上方富含血小板和白細(xì)胞的血漿，并對(duì)第一次離心后獲得的PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)。

3.3 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將第一次離心獲得的PRP分成兩部分，一部分進(jìn)行第二次離心，另一部分留作重懸血小板。

3.4 第二次220 g離心20 min，離心結(jié)束后，在超凈臺(tái)內(nèi)將上清轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，獲得貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）；將剩余血小板沉淀用留置的PRP進(jìn)行重懸，充分混勻后獲得PRP，并進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3.5 通過(guò)計(jì)數(shù)，用PPP調(diào)節(jié)PRP的血小板數(shù)量為800×109/L。

3.6 用葡萄糖酸鈣和凝血酶凍干粉按1 mL∶100 U配比混勻，得到混合液。

3.7 將PRP和上述混合液按1∶10配比混合，制成PRP凝膠。

3.8 將PRP凝膠靜置在培養(yǎng)皿中，30 min后收凝膠析出液。

3.9 用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)全血和析出液中白細(xì)胞和血小板含量。

4 富血小板纖維蛋白的制備

4.1 同時(shí)抽取上述4名志愿者靜脈血各10 mL于真空干燥管，立即轉(zhuǎn)入離心機(jī)，3 000 g離心12 min。

4.2 離心后取出，此時(shí)離心管內(nèi)分為三層，上層為血清，中間層為PRF，底層為紅細(xì)胞。靜置5～10 min后吸去最上層的貧血小板血漿，并剪去最下層的紅細(xì)胞層，獲得PRF。

4.3 將其靜置在培養(yǎng)皿中，30 min后收集PRF析出液。

4.4 將分別制備的PRF析出液進(jìn)行混合，用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)PRF析出液中血小板和白細(xì)胞含量。

5 氨芐西林溶液的制備 將氨芐西林溶于純水，配制成濃度為2 μg/mL的氨芐西林溶液。

6 菌種培養(yǎng)及鑒定

6.1 菌種的培養(yǎng)：分別用TSB肉湯和LB肉湯培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，然后分別重懸于生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x分別將兩種菌液濃度調(diào)節(jié)為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU/mL）后，按1∶1比例混合調(diào)整濃度至OD595=0.5，用掃描電鏡鑒定菌種混合情況。

6.2 混合菌的鑒定

6.2.1 將菌液進(jìn)行離心，5 000 r/min離心3 min，去上清，加2.5%的戊二醛溶液1 mL，充分混勻，重懸菌液，4 ℃固定4 h。

6.2.2 再次離心，5 000 r/min離心3 min，去上清，加入500 μL PBS 漂洗混合菌菌體3次，每次15 min；加1%鋨酸500 μL，充分混勻，固定2 h后，5 000 r/min離心3 min，去上清，加入500 μL PBS 漂洗混合菌菌體3次，每次15 min。

6.2.3 用梯度濃度分別為20%、50%、80%、100%的乙醇溶液脫水，每種濃度處理10 min，5 000 r/min離心3 min，去上清。

6.2.4 加入200 μL 100%叔丁醇，4℃放置20～30 min后，5 000 r/min離心3 min，再加入200 μL 100%叔丁醇，漂洗混合菌菌體3次，每次15 min。最后進(jìn)行涂片。

6.2.5 涂片自然風(fēng)干，密封4℃保存，等待上樣鑒定。

6.3 抑菌效果的鑒定：在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入15 mL 50℃的LB瓊脂固體培養(yǎng)基，冷卻至室溫凝固后，將上述菌液均勻涂布在固體瓊脂表面。然后將已滅菌的牛津杯慢慢放置于培養(yǎng)皿的適當(dāng)位置。將200 μL生理鹽水（對(duì)照組）、氨芐西林溶液、PRP凝膠和PRF分別加入到牛津杯中，置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果（圖1）。

圖1 牛津杯打孔-預(yù)加菌液傾注平板

7 結(jié)果判讀 用標(biāo)準(zhǔn)游標(biāo)卡尺測(cè)定各組的抑菌圈直徑，評(píng)價(jià)不同物質(zhì)的抑菌能力。參考抗菌藥物藥敏試驗(yàn)等級(jí)劃分[全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第三版）]判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。抑菌圈的直徑＞20 mm為極度敏感，抑菌圈的直徑15～20 mm為高度敏感，抑菌圈的直徑10～15 mm為中度敏感，抑菌圈的直徑＜10 mm為低度敏感，無(wú)抑菌圈則為不敏感。

8 統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，抑菌圈直徑均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板和白細(xì)胞含量的檢測(cè) 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)4例PRF析出液、PRP凝膠析出液及全血中的血小板和白細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，其血小板含量分別為（92.00±7.26）×109/L、（961.75±66.53）×109/L、（279.25±12.87）×109/L；白細(xì)胞含量分別為（1.08±0.39）×109/L、（0.10±0.00）×109/L、（5.65±1.24）×109/L，見(jiàn)圖2。

圖2 三組血小板和白細(xì)胞含量比較

2 混合菌中細(xì)菌的鑒定 混合菌接種于LB瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后取出，可檢測(cè)到平板上同時(shí)有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌（金黃色葡萄球菌形態(tài)為球形，大腸桿菌形態(tài)為短小桿菌）的菌落形成，說(shuō)明已形成混合菌，見(jiàn)圖3。

圖3 平板上混合菌的掃描電鏡圖

3 PRF對(duì)混合菌的抑菌效果鑒定 由圖4可見(jiàn)，PRF組、PRP凝膠和氨芐西林溶液的抑菌圈大小分別為（19.00±0.61）mm、（17.13±0.57）mm和（16.40±0.89）mm。抑菌圈直徑均數(shù)比較采用單因素方差分析，F(xiàn)=10.903，P＜0.05。兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，PRF組與PRP凝膠組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PRF與氨芐西林溶液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)混合菌的抑菌效果都屬于高敏，但PRF對(duì)混合菌的抑菌效果最明顯，見(jiàn)圖5。

圖4 各組抑菌圈直徑均數(shù)比較

圖5 各組抑菌效果（左：PRP凝膠；中：氨芐西林溶液；右：PRF）

討 論

慢性難愈性創(chuàng)面有發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、影響因素多、治療難度大和病程時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此一直采用多種方法聯(lián)合的方式進(jìn)行治療。我國(guó)的慢性難愈性創(chuàng)面發(fā)病率是外科總住院率的1.5%～3%，雖然比例不高，但也嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給患者家庭造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。

慢性難愈性創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，不同疾病、不同部位創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制存在較大差異，但共同點(diǎn)有局部微循環(huán)障礙、創(chuàng)面產(chǎn)生多種細(xì)菌、組織缺血缺氧、生長(zhǎng)因子和活性物質(zhì)異常、產(chǎn)生大量基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織再生能力差和細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)抗菌藥物特異性或非特異性的耐受等。其中，創(chuàng)面產(chǎn)生多種耐藥的細(xì)菌是慢性難愈性創(chuàng)面的主要影響因素[3]。有大量文獻(xiàn)指出，在慢性難愈性創(chuàng)面中，檢出率最高的病原菌有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等[4-6]。其中，金黃色葡萄球菌感染的危害最大，其通過(guò)產(chǎn)生大量的黏附毒素、細(xì)胞毒素、侵襲性酶等毒性物質(zhì)，溶解新生的上皮細(xì)胞、破壞皮膚黏膜組織、干擾人體的免疫機(jī)能，從而導(dǎo)致創(chuàng)面持久不愈[7]。大腸桿菌是創(chuàng)面形成假膜和濃苔的主要原因，常見(jiàn)于燒傷難愈創(chuàng)面[8]。有些創(chuàng)面的細(xì)菌是單一菌種，但更多的創(chuàng)面是混合菌種[9]，因此也更難愈合。

慢性難愈性創(chuàng)面的治療通常是以多學(xué)科協(xié)同治療為主，在改善基礎(chǔ)疾病的同時(shí)，通過(guò)各種治療方法加上抗菌藥物聯(lián)合治療[10]。主要的治療方法有非手術(shù)治療方法和負(fù)壓吸引技術(shù)（VSD）等。其中非手術(shù)治療方法有超聲波、高壓氧、局部灌洗及人工光源輻射等[3]。隨著新型敷料的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，局部應(yīng)用水凝膠敷料、含銀離子抗菌敷料和中藥制劑，是近幾年受到臨床醫(yī)生關(guān)注的治療方法，雖然都能起到一定抑菌作用，但是重復(fù)多次使用納米銀敷料，會(huì)存在銀中毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)[11]，而中藥會(huì)因個(gè)體差異而導(dǎo)致療效不穩(wěn)定[12]。

開(kāi)發(fā)合成抗菌肽（AMP）是國(guó)外治療慢性難愈性創(chuàng)面耐藥菌的研究熱點(diǎn)之一，與內(nèi)源性抗微生物肽相比，AMP具有更低的毒性和更高的活性，而且其顯示出更加廣譜的抗菌活性、低耐藥率、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)傷口愈合的活性[13]。

PRP治療慢性難愈性創(chuàng)面，是得到國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)生認(rèn)可的一種新興治療方法。PRP富含血小板、白細(xì)胞及抗菌肽，可改善難愈創(chuàng)面的免疫環(huán)境，降低感染和炎癥。通過(guò)凝血酶和鈣離子激活后，還可釋放大量血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)組織創(chuàng)面的修復(fù)。因其來(lái)源于自體，安全性高且制備方法簡(jiǎn)單，已在臨床上廣泛應(yīng)用[14]。

PRF作為PRP的第二代血小板濃縮制品，由靜脈全血離心濃縮制備而成，由于在制備過(guò)程中沒(méi)有添加如凝血酶等其他外源性生物藥劑，因此制備的成品規(guī)避了潛在傳染病風(fēng)險(xiǎn)[15]。PRF富含與PRP相同的多種生長(zhǎng)因子，也可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖、分化，還能促進(jìn)血管、神經(jīng)的修復(fù)。PRF在激活后，會(huì)形成一種緊密高密度的立體三維纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其釋放的內(nèi)容物以化學(xué)鍵的方式結(jié)合，在該結(jié)構(gòu)中持續(xù)緩慢釋放[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，PRF的持續(xù)釋放時(shí)間可達(dá)7～14 d[17]，而PRP在添加葡萄糖酸鈣和凝血酶激活后，在10 min內(nèi)會(huì)釋放70%的生長(zhǎng)因子，1 h內(nèi)即幾乎全部釋放，作用時(shí)間較短[18]。

PRF除了能釋放大量生長(zhǎng)因子外，還可釋放白細(xì)胞和多種抗菌肽[19]，因此對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等單一菌有抑制作用[20-22]，但對(duì)混合菌的抑菌效果卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面中常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)制成混合菌，并用PRF進(jìn)行體外抗菌，以此驗(yàn)證其抑菌效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRP的血小板濃度約為全血的3.5倍，幾乎不含白細(xì)胞；而PRF的血小板和白細(xì)胞濃度分別為全血的1/3和1/5。導(dǎo)致PRP和PRF血小板濃度不同的原因是PRP制備時(shí)可調(diào)節(jié)血小板濃度，而PRF不可；另一個(gè)原因是PRF的血小板和白細(xì)胞離心后，血小板和白細(xì)胞都負(fù)載到纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中，因此不能完全在析出液中檢測(cè)到。雖然PRF的血小板含量沒(méi)有全血和PRP高，但抑菌效果卻比PRP優(yōu)異，抑菌圈直徑比較有明顯差異（P＜0.05），推斷有以下兩個(gè)原因：①PRF制備過(guò)程只需一次離心，棄去的纖維蛋白原相對(duì)較少，在相對(duì)高速的離心下其形成的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)更加致密、穩(wěn)固，不易被水解，從而使各種因子得以緩慢釋放并發(fā)揮生物學(xué)作用；②PRF的纖維蛋白在自然凝集過(guò)程中可以網(wǎng)絡(luò)大量白細(xì)胞和抗菌肽等物質(zhì)，同時(shí)釋放一定濃度的抗炎因子，使得抑菌作用更明顯。

除此之外，PRF體外的抑菌效果也優(yōu)于氨芐西林，這提示使用PRF在一定程度上可替代常規(guī)抗菌藥物進(jìn)行抑菌治療，而且PRF來(lái)源于自體，沒(méi)有添加任何外源物，在臨床上使用更安全有效，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，PRF除了對(duì)單一菌有抑菌作用外，對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面常見(jiàn)的混合菌也有良好的抑菌效果，我們下一步將進(jìn)行難愈性創(chuàng)面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證PRF的抑菌效果，為臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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