朱曉琴 錢 進 王永霞 馬宗麗

江蘇省如皋市人民醫(yī)院(226500)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡婦女的多發(fā)病、常見病，發(fā)病率達10%～15%[1]。研究其發(fā)生發(fā)展機制，有助于探尋早期診斷、靶向治療與預后判斷等標志物。環(huán)氧化酶-2(COX-2)與疾病病理過程中細胞的黏附、侵襲、血管生成具有直接或間接的作用[2]。李燦宇[3]等研究表明，COX-2在卵巢子宮內(nèi)膜異位組織中表達水平升高，參與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展?；|(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)，在消化基底膜和細胞外基質(zhì)、誘導癌細胞的遷移、促進腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用[4]。肖莉[5]等研究表明，MMP-14和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達升高，二者具有協(xié)同作用，參與了腫瘤性病變的形成和進展。目前COX-2與MMP-14在EMs研究報道不多。本研究檢測COX-2、MMP-14在Ems組織中的表達情況，探討與病情發(fā)生發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月-2020年3月在本院婦產(chǎn)科經(jīng)腹腔鏡手術及術后病理證實為EMs患者115例為EMs組，年齡(33.4±4.5)歲(20～48歲)。納入標準：①術后經(jīng)病理診斷為EMs且取在位內(nèi)膜組織；②近3月內(nèi)未服用對子宮內(nèi)膜增殖有影響的藥物或激素類藥物。排除標準：①合并有其它內(nèi)分泌疾??；②子宮發(fā)育異常；③惡性腫瘤史或免疫系統(tǒng)疾病；④臨床資料不全。同期因子宮肌瘤行手術治療并經(jīng)病理證實子宮內(nèi)膜無異常的50例為對照組，年齡(32.5±5.4)歲(22～50歲)。研究經(jīng)本院倫理委員會批準?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 主要試劑與儀器

鼠抗人COX-2單克隆抗體、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠抗人MMP-14多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自Santa Cruz公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于北京天根生化有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自于大連TAKARA公司，COX-2、MMP-14及GAPDH引物，由上海生工生物公司設計與合成。qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。糖類抗原(CA125)檢測試劑購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 COX-2、MMP-14 mRNA檢測

1.3.1樣品采集及保存術前取患者空腹靜脈血抗凝取上清，檢測CA125水平。術中取子宮內(nèi)膜組織，一部分采用RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測RNA濃度與純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?；另一部分加入福爾馬林溶液浸泡固定，包埋后常溫保存。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測總反應體系25μl。反應條件：95℃，120s；95℃，45s；65℃，45s；72℃，30s；40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔。反應結(jié)束后，以GAPDH作為內(nèi)參，計算COX-2、MMP-14 mRNA表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫組織化學染色法檢測將石蠟包埋組織切成4μm薄片，常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)過高壓熱修復后，加3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，加牛血清封閉，滴加鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人MMP-14多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜；再加羊抗鼠二抗，使用免疫組化試劑盒染色。最后染色，封片。顯微鏡下觀察，采集圖像。細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒為陰性。對每張切片任意選擇5個高倍視野，觀察陽性細胞表達強度并評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計算陽性細胞比例：<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分；免疫組化最終評分為陽性率評分與強度評分相乘所得之積：0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(+ +)，>6分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜組織及血清指標水平比較

EMs組子宮內(nèi)膜組織中COX-2、MMP-14 mRNA表達水平及血清CA125水平均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組各指標檢測水平比較

2.2 子宮內(nèi)膜組織COX-2和MMP-14蛋白表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，EMs組COX-2、MMP-14陽性表達率均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組子宮內(nèi)膜組織COX-2和MMP-14蛋白表達比較[例(%)]

2.3 EMs組COX-2、MMP-14表達與CA125水平相關性

相關性分析顯示，EMs患者COX-2、MMP-14表達水平均與血清CA125呈正相關(r=0.619、0.515，均P<0.05)。

2.4 COX-2、MMP-14診斷EMs價值

COX-2預測EMs曲線下面積為0.832，截斷值為1.28，敏感度為74.8%，特異性為82.0%；MMP-14預測EMs曲線下面積為0.889，截斷值為1.37，敏感度為78.3%，特異度為88.0%；COX-2聯(lián)合MMP-14預測EMs曲線下面積為0.913，敏感度為86.1%，特異度為86.0%。

3 討論

EMs中70%～80%患者有不同程度的盆腔疼痛，40%～50%合并不孕，手術和藥物是主要治療手段，但存在不良反應多、復發(fā)率高等問題[6-7]。發(fā)病原因目前尚未明確，探究其發(fā)病機制有重要臨床指導意義。

COX是前列腺素(PG)合成中重要的限速酶，被廣泛認為是炎癥過程中的重要誘導酶之一。研究顯示COX-2基因在EMs在位內(nèi)膜中表達增高[8]；COX-2 參與多種惡性腫瘤如胃癌等的發(fā)生發(fā)展，還有促進腫瘤血管生成并參與細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]；劉斌[10]等研究表明，EMs患者COX-2 mRNA在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中均高表達；姚燕婷[11]等研究表明，EMs患者血清CA125與子宮內(nèi)膜COX-2水平呈正相關性，且兩指標聯(lián)合檢測對早期診斷EMs有較高價值。有研究報道，EMs患者在位和異位子宮內(nèi)膜和卵巢子宮內(nèi)膜異位組織中Cox-2 mRNA的表達顯著增加，Cox-2 mRNA表達與血清CA125和子宮內(nèi)膜瘤的直徑顯著相關[12]。本研究結(jié)果顯示，COX-2在EMs組子宮內(nèi)膜組織中mRNA表達水平與蛋白陽性表達率均高于對照組，提示COX-2可能與EMs的發(fā)生有關。MMP-14主要參與細胞外基質(zhì)蛋白水解、外泌體運輸以及細胞遷移和侵襲，特別是MMP-14對角膜新生血管形成具有促進作用[13]。有研究表明，在有活動性新血管形成的糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中，MMP-14表達升高且與VEGF呈正相關[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，MMP-14在EMs組中高表達，提示MMP-14可能促進細胞增殖，與EMs發(fā)生發(fā)展有關。

目前EMs病因及發(fā)病機制不清，但多數(shù)學者認為異位內(nèi)膜細胞的黏附、侵襲、血管生成是主要病理生理過程[15]。本研究結(jié)果顯示，EMs組COX-2、MMP-14表達水平升高，可能與COX-2、MMP-14促進血管生成、參與細胞增殖與侵襲有關。雖然EMs為良性疾病，但也具有一些與腫瘤類似的生物學特性，如侵襲性和對正常組織的損傷性，且已有研究表明，EMs與卵巢癌發(fā)生發(fā)展有密切關系[16]。CA125普遍存在于子宮體腔上皮化生組織的細胞膜表面，有研究表明[17]，EMs患者血清中CA125升高，有助于臨床診斷。本研究結(jié)果顯示，EMs患者COX-2、MMP-14表達均與血清CA125水平呈正相關。進一步分析，COX-2、MMP-14聯(lián)合預測EMs有較好診斷價值，提示COX-2、MMP-14對早期EMs診斷的指導意義。

綜上所述，COX-2、MMP-14在EMs患者子宮內(nèi)膜中高表達，與患者血清CA125水平相關，可能作為早期診斷EMs的分子標志物。但由于本研究臨床樣本數(shù)據(jù)少，仍需擴大樣本量進一步驗證結(jié)論。