錢(qián) 進(jìn) 朱曉琴 王永霞 馬宗麗

江蘇省如皋市人民醫(yī)院(226500)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是婦科良性增殖性疾病，在育齡婦女中發(fā)病率達(dá)到5%～10%[1]?？蓪?dǎo)致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性盆腔粘連，不孕女性中35%～50%為EMs[2]。EMs發(fā)病率高且病因復(fù)雜，一直是婦科疾病治療難點(diǎn)，研究EMs的機(jī)制具有重要價(jià)值[3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者的血液和在位、異位內(nèi)膜組織中的前列腺素E2(PGE2)均高于正常女性[4]，其在異位組織的存活和免疫逃逸方面可能起到關(guān)鍵作用。環(huán)氧化酶(COX)是PG生物合成的限速酶[5]，亞型包括組成型COX-1和誘導(dǎo)型COX-2，在EMs患者腹膜巨噬細(xì)胞[6]和異位的子宮內(nèi)膜病灶組織[7]都存在著COX-2的表達(dá)升高。微小RNA-26b (MiR-26b)基因與肝癌[8]、結(jié)腸癌[9]、食管癌[10]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，近期研究發(fā)現(xiàn)MiR-26b在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)[11]。EMs存在一定的惡變可能，本研究探討EMs在位內(nèi)膜組織中MiR-26b和COX-2的表達(dá)及其意義，為臨床機(jī)理研究提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

2015年5月-2019年12月本院確診并治療的EMs患者195例(EMs組)，年齡24～43歲，月經(jīng)周期26～39d；因?qū)m頸病變接受子宮肌瘤切除術(shù)或全子宮切除術(shù)無(wú)EMs患者50例(對(duì)照組)，年齡26～44歲，月經(jīng)周期25～40d。兩組患者均不合并內(nèi)分泌性、免疫性疾病，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)激素類(lèi)藥物。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)。

1.2 標(biāo)本采集

取EMs組在位內(nèi)膜組織、對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織，標(biāo)本1份-80℃保存，另1份浸于10%甲醛中。

1.3 COX-2檢測(cè)

免疫組化法檢測(cè)。將甲醛浸泡的標(biāo)本脫水、浸蠟、包埋后切片，石蠟切片預(yù)處理后置92℃，pH6.0的枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液中修復(fù)抗原。采用ABC免疫酶染色法，以0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，甩去封閉液，滴加稀釋的一抗振洗，滴加稀釋的二抗振洗，滴加三抗振洗，加入顯色液孵育，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)吸去顯色液，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，無(wú)水乙醇梯度脫水，透明后用中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察?？瞻讓?duì)照用PBS做一抗。高倍視野下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率。染色強(qiáng)度分為0(不顯色或顯色不清)、1(淺黃色)、2(粽黃色)、3(深褐色)。染色陽(yáng)性率得分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0，5%～25%為1，25%～50%為2,50%～75%為3,>75%為4。表達(dá)水平=染色強(qiáng)度得分×染色陽(yáng)性率得分。

1.4 MiR-26b檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)檢測(cè)。取低溫凍存的內(nèi)膜組織研磨成粉末狀，加入RNA抽提試劑Trizol繼續(xù)研磨，至裂解液呈現(xiàn)透明狀，離心取上清液，加入氯仿后離心，吸取無(wú)色的上清液加入異丙醇后再次離心，清洗RNA沉淀，對(duì)提取的總DNA進(jìn)行純化。RNA逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒(日本Taraka公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，按照95℃ 3min，62℃ 40～60s，循環(huán)40次，進(jìn)行擴(kuò)增。以U6snRNA作為對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，記錄各反應(yīng)管樣本的CT值，2△△CT法計(jì)算MiR-26b基因表達(dá)。

1.5 臨床觀察指標(biāo)

對(duì)EMs患者采用美國(guó)生育協(xié)會(huì)提出的修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法(r-AFS)進(jìn)行分期[12]；疼痛采用VAS評(píng)分[13]，0分為無(wú)痛，10分為無(wú)法忍受的劇痛，將疼痛分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共5級(jí)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析。兩組COX-2和MiR-26b表達(dá)組間比較采用秩和檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)分析對(duì)COX-2、MiR-26b與EMs分期和疼痛分級(jí)的相關(guān)性，分析COX-2與MiR-26b表達(dá)相關(guān)性。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2表達(dá)水平

子宮內(nèi)膜組織中COX-2得分對(duì)照組均在4分以下，平均得分2.32分；EMs組得分集中在4分、5分，平均得分4.39分。見(jiàn)表1。EMs組COX-2表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 兩組COX-2表達(dá)得分分布[例(%)]

2.2 MiR-26bmRNA表達(dá)水平

EMs組MiR-26b mRNA的表達(dá)(0.81±0.27)低于對(duì)照組(1.93±0.46)(P<0.05)。

2.3 EMs組COX-2、MiR-26b與分期和疼痛的相關(guān)性

EMs組不同EMs分期和疼痛分級(jí)患者的COX-2和MiR-26b表達(dá)水平見(jiàn)表2，隨著疼痛分級(jí)的提高，COX-2得分逐漸升高、MiR-26b逐漸降低(P<0.05)；COX-2與疼痛分級(jí)正相關(guān)(r=0.724)，MiR-26b與疼痛分級(jí)負(fù)相關(guān)(r=0.308)，r-AFS分期與COX-2和MiR-26b表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。

表2 EMs不同程度患者 COX-2、MiR-26b表達(dá)

2.4 COX-2與MiR-26b的相關(guān)性

子宮內(nèi)膜組織中COX-2與MiR-26b表達(dá)水平EMs組呈負(fù)相關(guān)(r=-0.522，P<0.05)，對(duì)照組無(wú)明顯相關(guān)性。

3 討論

EMs發(fā)病機(jī)制有子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、在位內(nèi)膜決定論等不同學(xué)說(shuō)[14]。雖然EMs發(fā)生發(fā)展機(jī)制并未完全明確，但COX-2在子宮內(nèi)膜在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中均有表達(dá)，其參與了EMs病理過(guò)程已被證實(shí)。Ceyhan等[15]觀察到Cox-2主要在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)主要在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，COX-2和VEGF間存在密切相關(guān)性，二者協(xié)同在卵巢子宮內(nèi)膜異位的血管生成中發(fā)揮作用。何美蓉等[16]研究證實(shí)選擇性COX-2抑制劑通過(guò)影響胃潰瘍大鼠胃組織PGs代謝下調(diào)bFGF和bFGFR mRNA的表達(dá)，抑制了大鼠胃潰瘍底部微血管的形成，顯著延緩潰瘍愈合，即抑制COX-2表達(dá)可抑制微血管的形成。正常子宮內(nèi)膜有周期性改變，通過(guò)細(xì)胞凋亡蛋白的周期性表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控。在COX-2表達(dá)上調(diào)的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中，凋亡蛋白Bax和BclXL的表達(dá)降低，說(shuō)明COX-2通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)，使內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率下降[17]。

EMs的發(fā)生發(fā)展中，增殖與凋亡的調(diào)節(jié)異常是重要環(huán)節(jié)，mirRNA通過(guò)與mRNA的3’UTR結(jié)合降解靶mRNA調(diào)控蛋白編碼基因。與內(nèi)膜異位有關(guān)的基因已有大量臨床報(bào)道。張倩[18]等研究顯示，與在位內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜組織的miR-20b-5p的表達(dá)下調(diào)，與正常內(nèi)膜相比，在位內(nèi)膜組織iR-20b-5p表達(dá)上調(diào)，而異位內(nèi)膜組織中PTEN mRNA表達(dá)增加，在位內(nèi)膜組織的PTEN mRNA表達(dá)減少，miR-20b-5p與PTEN mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示內(nèi)膜的增殖能力增強(qiáng)而凋亡能力減弱，有助于子宮內(nèi)膜在異位存活。許曉月[19]等發(fā)現(xiàn)，miR-15b、miR-17-5p、miR-222可能通過(guò)調(diào)控血管形成相關(guān)基因的表達(dá)參與EMs的病理過(guò)程。卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組織較在位內(nèi)膜組織miR-15b表達(dá)升高，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組織和細(xì)胞較在位內(nèi)膜miR-222表達(dá)增加、miR-17-5p表達(dá)下降，卵巢異位內(nèi)膜中miR-222與VEGFmRNA的表達(dá)、miR-17-5p與TSP-1mRNA的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫較在位內(nèi)膜，血管調(diào)控相關(guān)的miRNA表達(dá)存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMs組在位內(nèi)膜MiR-26b表達(dá)降低，COX-2表達(dá)升高，COX-2與MiR-26b表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而對(duì)照組COX-2與MiR-26b表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。陳政綱等[20]使用miR-26b mimic轉(zhuǎn)染人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87，上調(diào)miR-26b的表達(dá)，檢測(cè)了miR-26b mimic轉(zhuǎn)染后miR-26b和COX-2 mRNA的表達(dá)變化，使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK-8檢測(cè)miR-26b對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87侵襲能力、遷移能力、增殖能力的影響。結(jié)果顯示miR-26b可通過(guò)抑制COX-2表達(dá)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲和遷移。我們推斷EMs內(nèi)膜中的MiR-26b同樣可能通過(guò)抑制COX-2而參與調(diào)控，這需要通過(guò)后續(xù)研究加以證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)COX-2與EMs患者的疼痛分級(jí)正相關(guān)，這可能是由于COX-2消耗花生四烯酸產(chǎn)生PGE2[21]，PEG2為致痛性的炎性因子[22]，可引起在位和異位子宮內(nèi)膜收縮導(dǎo)致疼痛。隨著COX-2產(chǎn)物PEG2的增加，EMs患者的疼痛程度上升，疼痛分級(jí)上升。MiR-26b抑制COX-2的表達(dá)，這可能是本研究結(jié)果MiR-26b與疼痛分級(jí)負(fù)相關(guān)的原因。

總體而言，在EMs在位子宮內(nèi)膜中COX-2高表達(dá)、MiR-26b表達(dá)下調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，MiR-26b可能參與了EMs病理過(guò)程中COX-2的調(diào)節(jié)。