劉新榮 劉永華 楚蔚琳

青島市市立醫(yī)院(266000)

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率高，目前治療方法以手術(shù)后化療最為常見，而化療藥品中紫杉醇應(yīng)用較為廣泛[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)可能作為一類新的癌基因或抑癌基因在腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生和生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用[2]。由于miRNA可在翻譯水平上抑制基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，推測(cè)可能與癌細(xì)胞是否耐藥存在相關(guān)性。為驗(yàn)證上述猜測(cè)，本研究通過基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞耐藥與敏感的miRNA表達(dá)差異，并通過Western Blot方法對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，為提高卵巢癌的有效治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本獲取及檢測(cè)

選擇2016年3月-2020年3月在本院治療的卵巢癌患者病變標(biāo)本。利用mirVanaTMRNA Isolation試劑盒(美國(guó)Ambion公司)提取 RNA?？俁NA濃度、純度和完整性的驗(yàn)證利用Agilent 2100 Bio analyzer系統(tǒng)自動(dòng)分析。耐藥與敏感細(xì)胞均使用1640培養(yǎng)基(10%FBS，青霉素100mg/L，鏈霉素100mg/L)，在30nmol/L紫杉醇條件下，使得SKOV3-TR30細(xì)胞維持耐藥。在穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為溫度37.5℃、濕度飽和、5%CO2。

1.2 芯片雜交及數(shù)字化處理

將提取出的RNA通過添加多聚腺苷酸尾(polyA)與熒光標(biāo)記鏈接，應(yīng)用miRNA寡核苷酸基因芯片試劑盒(Affymetrix)進(jìn)行芯片雜交。按照Gene Chip Hybridization Wash and Stain(Affymetrix)試劑盒，全自動(dòng)洗脫染色工作站(Fluidics Station 450)進(jìn)行染色。Affymeterix GeneChip Commond Console 1.1軟件讀取圖像文件得到Cel原始數(shù)據(jù)；應(yīng)用miRNA QC tool 處理得到txt標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。與SKOV3相比，當(dāng)比值>1時(shí)認(rèn)為miRNA高表達(dá)，<1時(shí)低表達(dá)。采用Real-time PCR對(duì)芯片進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 miRNA目標(biāo)靶基因分析及其蛋白表達(dá)

為提高靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，利用4種生物學(xué)分析軟件進(jìn)行綜合分析，篩選3種以上軟件中有共同結(jié)果的基因作為靶基因，其中用到的生物學(xué)軟件有Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets，采用方法為缺省設(shè)置綜合分析。采用Realtime PCR進(jìn)行靶基因表達(dá)檢測(cè)，Western Blot方法驗(yàn)證靶基因蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病例基本資料

紫杉醇耐藥患者19例，年齡(55.7±6.8)歲，漿液性癌8例、黏液性癌7例、子宮內(nèi)膜樣癌4例，腫瘤分期I～Ⅱ期10例、Ⅲ～Ⅳ期9例；非紫杉醇耐藥患者21例，年齡(54.8±5.9)歲，漿液性癌9例、黏液性癌8例、子宮內(nèi)膜樣癌3例，腫瘤分期I～Ⅱ期11例、Ⅲ～Ⅳ期10例。兩組患者年齡、腫瘤類型、分期無差異(P>0.05)。

2.2 miRNA差異表達(dá)分析

經(jīng)芯片雜交和數(shù)字化處理后分析結(jié)果可見，卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥與敏感相比miR-17、miR-92-1、miR-1307等68個(gè)miRNAs高表達(dá)，miR-34、miR-134、miR-196b等101個(gè)基因低表達(dá)，其中miR-134基因與卵巢癌耐藥相關(guān)性較大(P<0.05)。見表1。

表1 紫杉醇耐藥與敏感卵巢癌細(xì)胞中miR-134表達(dá)情況比較

探針SKOV3TR30表達(dá) P SKOV3表達(dá) P 比值hasmiR37927.931370.2785161110.73871.94171E080.252hasmiR38213.151120.597778379.827531.94773E080.165hasmiR4093p21.578950.206733219.84611.03E060.098hasmiR4853p9.711260.85127530.263360.03917140.303hasmiR487a15.154960.495777561.732838.46275E070.241hasmiR487b37.231480.0214586154.33791.91373E080.241hasmiR6543p17.035850.398860145.967723.80035E050.372

2.2 紫杉醇耐藥與非耐藥患者標(biāo)本miR-134表達(dá)

紫杉醇耐藥患者標(biāo)本miR-134表達(dá)水平(0.59±0.36)低于非耐藥患者標(biāo)本(1.28±0.47)(P<0.01)。

2.3 兩種細(xì)胞中miR-134表達(dá)

將紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細(xì)胞系中miR-134含量設(shè)定為1并作為對(duì)照組，以SKOV3細(xì)胞系中miR-134含量與之比較，得出SKOV3細(xì)胞中miR-134含量為1.343(P<0.05)。

2.4 miRNA靶基因檢測(cè)

采用Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets 4個(gè)生物信息學(xué)分析軟件綜合分析，對(duì)miR-134基因進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。選取至少3種軟件的共同結(jié)果作為靶基因，最終預(yù)測(cè)出miR-134的靶基因有c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等共128個(gè)。

2.5 miR-134靶基因蛋白表達(dá)

Western Blot方法檢測(cè)，紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細(xì)胞中c-Myc靶基因編碼的蛋白較敏感的SKOV3細(xì)胞高表達(dá)(P<0.05)；Cdc42基因和MRPY基因編碼的蛋白在耐藥與非耐藥細(xì)胞中表達(dá)無差異(P>0.05)。見圖1、表2。

圖1 SKOV3和SKOV3-TR30細(xì)胞c-Myc、BIM、PTEN蛋白的Western Blot結(jié)果

表2 各細(xì)胞系中靶基因蛋白的相對(duì)含量(相對(duì)灰度比值)

2.6 miR-134調(diào)控靶基因的表達(dá)

在紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細(xì)胞(miR-134低表達(dá))中過表達(dá)miR-134后，c-Myc基因表達(dá)下降，其編碼蛋白也隨之下降(P<0.05)，見圖2a、2b；在非耐藥的SKOV3細(xì)胞(miR-134高表達(dá))中敲低miR-134表達(dá)后，c-Myc基因表達(dá)上升，其編碼的蛋白也隨之上升(P<0.05)。見圖2c、2d。

圖2 miR-134調(diào)控靶基因表達(dá)

3 討論

3.1 miRNA概述

miRNA為非編碼小RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)，臨床上可作為腫瘤診斷、治療、預(yù)后判斷及器官移植的生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)[3]。隨著研究的深入，人們對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)逐漸突破了腫瘤的局限，越來越多的疾病和組織中miRNA的表達(dá)及作用受到了學(xué)者們關(guān)注。miRNA首先在細(xì)胞核中由初級(jí)miRNA通過錨蛋白DGCR8或套索脫支酶作用形成前體miRNA，再由RNA酶III家族成員Dicer加工裂解為成熟雙鏈miRNA，其中一條miRNA鏈通過與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合，從而降解或阻遏靶基因的翻譯，使靶基因在細(xì)胞中差異性表達(dá)來發(fā)揮調(diào)控作用[4]。目前已知幾百個(gè)miRNA調(diào)控人類30%以上的蛋白編碼基因，通過降解目的基因表達(dá)調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，廣泛參與人類機(jī)體多種生理病理過程[5]。

3.2 miRNA134與腫瘤關(guān)系

隨著基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，基因水平的研究在癌癥治療中作用日漸突出。不斷有研究證實(shí)miRNA參與影響了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感和耐藥[6]。miRNA可在翻譯水平上參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程[7]。學(xué)者們通過兩個(gè)發(fā)現(xiàn)找到了miRNA與惡性腫瘤的關(guān)系：一是miRNA定位在癌相關(guān)基因組區(qū)及基因組不穩(wěn)定區(qū)域；二是miRNA在正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)不同，幾乎所有腫瘤存在miRNA表達(dá)異常[8]。目前發(fā)現(xiàn)的50%以上miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)，說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中的重要作用[9]。

3.3 miR-134與卵巢癌細(xì)胞的耐藥性

已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125、miR-182、miR-200等基因簇均可通過調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞的耐藥性[10]。Shuang T等[11]發(fā)現(xiàn)miR-134表達(dá)可影響卵巢癌細(xì)胞的耐藥性，且通過調(diào)控pak2來實(shí)現(xiàn)，但其靶基因和具體調(diào)控機(jī)制未闡明。本研究在特殊培養(yǎng)基上培養(yǎng)并篩選出紫杉醇耐藥(SKOV3-TR30)和敏感(SKOV3)的卵巢癌細(xì)胞系，通過miRNA芯片雜交技術(shù)篩選出兩種細(xì)胞系間差異表達(dá)的miRNA基因譜，發(fā)現(xiàn)共有169個(gè)miRNA差異性表達(dá)，其中有68個(gè)miRNA較紫杉醇敏感的卵巢癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，101個(gè)miRNA較之表達(dá)下調(diào)，其中miR-134表達(dá)下調(diào)最明顯。通過測(cè)定紫杉醇耐藥與非耐藥患者標(biāo)本miR-134表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，耐藥組miR-134表達(dá)低于非耐藥組。進(jìn)一步通過人體組織標(biāo)本驗(yàn)證了紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞miR-134表達(dá)降低的結(jié)論。

本次研究發(fā)現(xiàn)，miR-134在敏感卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有has-miR-134、has-miR-154、has-miR-299-3p、has-miR-376c、has-miR-379、has-miR-382、has-miR-409-3p、has-miR-485-3p、has-miR-487a、has-miR-487b、has-miR-654-3p，與Zhu H[12]等研究結(jié)果相似。綜合分析，我們預(yù)測(cè)得c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等128個(gè)基因?yàn)闈撛诎谢颍渲衏-Myc已有研究證實(shí)定位于8q24.21，在卵巢癌組織中擴(kuò)增率可達(dá)50%，被認(rèn)為是確定的癌基因[13]。為了驗(yàn)證該預(yù)測(cè)潛在靶基因，本研究利用Western Blot方法檢測(cè)c-Myc在兩種細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與敏感卵巢癌SKOV3細(xì)胞相比，耐藥SKOV3-TR30細(xì)胞中c-Myc靶基因蛋白高表達(dá)。c-Myc基因是myc基因家族的重要成員之一，是一種可調(diào)節(jié)多種物質(zhì)的基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)c-Myc基因在成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤中均出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，且過量表達(dá)與腫瘤的早期復(fù)發(fā)聯(lián)系密切[14]。在紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細(xì)胞(miR-134低表達(dá))中過表達(dá)miR-134后，c-Myc基因表達(dá)下降，其編碼蛋白也隨之下降；在非耐藥的SKOV3細(xì)胞(miR-134高表達(dá))中敲低miR-134表達(dá)后，c-Myc基因表達(dá)上升，其編碼的蛋白也隨之上升。與湯繼英雄[15]等研究結(jié)果相符。說明miR-134影響卵巢癌細(xì)胞耐藥機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)靶基因c-Myc來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本文得出結(jié)論：miR-134在紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞中較敏感癌細(xì)胞中低表達(dá)且影響耐藥，機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)c-Myc蛋白潛在靶基因影響c-Myc蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性。本課題組將繼續(xù)以miR-134對(duì)c-Myc表達(dá)的調(diào)控為切入點(diǎn)，在基因?qū)用嫣骄柯殉舶┌l(fā)生發(fā)展及細(xì)胞耐藥機(jī)制，為相關(guān)基因靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。