李偉，馬建群，朱玉紅

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濟(jì)南 250031； 2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256603)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，心血管疾病已成為影響人類(lèi)健康的首要問(wèn)題?！吨袊?guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》顯示，我國(guó)大約有3.3億心血管疾病患者，其中冠心病患者約有1 139萬(wàn)[1]。心肌缺血是動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死引起的常見(jiàn)臨床癥狀[2]。再灌注治療有利于修復(fù)缺血后損傷的心肌結(jié)構(gòu)，改善心功能。然而，再灌注也可能導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，從而加重心功能不全。缺血預(yù)處理、后處理和服用抗血小板或抗血栓藥物等已被用于緩解MIRI[3-4]。由于MIRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣，藥物防治的臨床研究結(jié)果并不一致。目前我國(guó)批準(zhǔn)使用的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑包括達(dá)格列凈、恩格列凈、卡格列凈，近年來(lái)已被廣泛研究[5-6]。達(dá)格列凈傳統(tǒng)上是一種降糖藥物，但多項(xiàng)研究表明其對(duì)缺血性心臟病和心力衰竭患者的心功能有益[7-9]。因此，達(dá)格列凈被認(rèn)為是MIRI的一種潛在治療方法。本研究主要探討達(dá)格列凈預(yù)處理對(duì)MIRI的影響，為進(jìn)一步拓展達(dá)格列凈在預(yù)防和治療心血管疾病中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取普通級(jí)雄性成年新西蘭大白兔18只，體重(2.0±0.3) kg，購(gòu)自濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心[許可證號(hào)：SCXK(魯)2020-0004]。所有兔按標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.1.2儀器與試劑 醫(yī)用低溫保存箱(BDF-86V348，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)，電子分析天平(JA2003，上海上天精密儀器有限公司)，醫(yī)用離心機(jī)(BY-320A，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(UD90DT，北京聯(lián)眾泰克科技有限公司)，全自動(dòng)包埋機(jī)(Tissue-Tek TEC)、全自動(dòng)脫水機(jī)(Tissue-Tek VIP)、全自動(dòng)染色封片一體機(jī)(Tissue-Tek Prisma)均購(gòu)自日本Sakura公司，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(RM2245，德國(guó)Leica公司)，全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描儀(寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司)；達(dá)格列凈(美國(guó)Astra Zeneca Pharmaceuticals LP公司，批號(hào)：2104240)；高敏心肌肌鈣蛋白T(high-sensitive cardiac troponin T，hs-cTnT)(北京聯(lián)眾泰克科技有限公司，批號(hào)：20210722)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記(teminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(批號(hào)：MPC2107025)、蛋白酶K(批號(hào)：MPC2107048)均購(gòu)自武漢賽維爾公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及心肌缺血再灌注模型制備 18只新西蘭大白兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、達(dá)格列凈組，每組6只。模型組參照文獻(xiàn)[10]的方法并進(jìn)行改良：經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，等待兔的四肢變得松軟，睫毛反射消失后將其固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臺(tái)上。連接心電圖機(jī)，胸前區(qū)備皮并消毒。沿胸骨左緣尋找第3～4肋間，切開(kāi)皮膚、皮下組織及部分肌肉，再用小止血鉗進(jìn)行鈍性分離，注意無(wú)氣胸開(kāi)胸，擦除血跡，如有組織內(nèi)小動(dòng)脈出血立即給予結(jié)扎。用擴(kuò)胸器充分撐開(kāi)以增加手術(shù)視野，用彎頭鑷子夾住胸膜，用眼科剪剪開(kāi)縱隔胸膜，然后用彎頭鑷子夾持壁層心包，緩慢提起，用眼科剪縱向剪開(kāi)壁層心包，充分暴露心臟。在手術(shù)野下用兩根棉簽輕輕夾持著心臟并向右側(cè)輕度旋轉(zhuǎn)以充分暴露冠狀動(dòng)脈的左前降支。用3-0縫合線在兔心臟左前降支中、上1/3交界處穿繞并在其表面平行放置一束線。觀察3～5 min后，記錄心電圖。將縫線穿過(guò)心肌，在束線上打兩個(gè)活結(jié)，并拉緊兩端，結(jié)扎左前降支。其特點(diǎn)是心電圖V1導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)明顯的ST段抬高，結(jié)扎線以下的心肌明顯發(fā)紺。整個(gè)手術(shù)過(guò)程中進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)。結(jié)扎40 min后，用彎頭鑷提起結(jié)扎處的縫合線和束線，用眼科剪剪斷，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈左前降支血流，使心肌缺血區(qū)進(jìn)行再灌注120 min。假手術(shù)組在左前降支的下方只穿線，不結(jié)扎；達(dá)格列凈組在結(jié)扎前20 min經(jīng)兔耳緣靜脈給予達(dá)格列凈0.5 mg/kg，其余步驟均不變。

造模評(píng)價(jià)：冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎成功的標(biāo)志是左心室前壁心肌顏色變暗、向外膨脹同時(shí)伴V1導(dǎo)聯(lián)心電圖顯示ST段抬高。成功的再灌注的特點(diǎn)是去除結(jié)扎后，心電圖上的ST段抬高減少≥50%。模型組與達(dá)格列凈組均造模成功。

1.2.2標(biāo)本采集 分別于結(jié)扎前、結(jié)扎后40 min、再灌注120 min時(shí)從心臟處收集血液1.5 ml，在4 ℃冰箱靜置30 min，以1 610×g離心15 min后收集上清液，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀統(tǒng)一檢測(cè)血清hs-cTnT水平。

1.2.3心肌組織病理學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從結(jié)扎線下1 mm的同一區(qū)域提取心肌組織，在10%甲醛溶液中固定，待蘇木精-伊紅染色。石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切出厚度為5 μm的切片。切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水洗、染色、脫水、透明、封片一系列過(guò)程后，光學(xué)顯微鏡下觀察，并進(jìn)行拍照。

1.2.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 在經(jīng)過(guò)脫蠟和脫水后，用TUNEL法檢測(cè)兔心肌組織切片的凋亡情況，該操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。凋亡指數(shù)=視野范圍內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)/視野范圍內(nèi)的所有心肌細(xì)胞數(shù)。每個(gè)切片在高倍鏡下對(duì)5個(gè)視野區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。其中凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈深褐色，而正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。

2 結(jié) 果

2.1兔心肌缺血再灌注過(guò)程中心電圖變化 將心電圖機(jī)的走紙速度設(shè)置為50 mm/s，定標(biāo)電壓為10 mm/mV，持續(xù)心電監(jiān)測(cè)并記錄單一胸導(dǎo)聯(lián)(將V1導(dǎo)聯(lián)放置于劍突與胸骨柄交界處)心電圖。與結(jié)扎前相比，兔冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后V1導(dǎo)聯(lián)的ST段迅速呈弓背向上抬高，見(jiàn)圖1a、1b；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，ST段逐漸下降，見(jiàn)圖1c。

2.2各組兔血清hs-cTnT水平比較 不同時(shí)點(diǎn)間hs-cTnT水平的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，不考慮測(cè)量時(shí)間，組間hs-cTnT水平的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，組間和時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.01)；結(jié)扎前3組hs-cTnT比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)扎后40 min和再灌注120 min，模型組與達(dá)格列凈組血清hs-cTnT均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.01)；結(jié)扎后40 min、再灌注120 min，達(dá)格列凈組血清hs-cTnT明顯低于模型組(P<0.01)；模型組與達(dá)格列凈組血清hs-cTnT均隨著缺血及再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P<0.01)。見(jiàn)表1。

圖1 兔心肌缺血再灌注過(guò)程中心電圖變化 1a為結(jié)扎前，1b為結(jié)扎后，1c為再灌注后

表1 三組兔血清hs-cTnT水平比較

2.3各組兔心肌缺血區(qū)組織病理變化 假手術(shù)組心肌組織蘇木精-伊紅染色表現(xiàn)為心肌細(xì)胞染色均勻，顏色深淺一致，心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間隙正常，未出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死，見(jiàn)圖2a。模型組的心肌組織病理改變明顯，心肌細(xì)胞染色深淺不一，細(xì)胞水腫明顯，排列紊亂，出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌纖維溶解斷裂，細(xì)胞核邊緣模糊顯示不清，見(jiàn)圖2b。達(dá)格列凈組心肌細(xì)胞紅染較假手術(shù)組略深，心肌纖維排列介于模型組和假手術(shù)組之間，未見(jiàn)嚴(yán)重的心肌纖維斷裂現(xiàn)象，細(xì)胞核邊緣較為清晰，見(jiàn)圖2c。

圖2 各組兔心肌缺血區(qū)組織病理切片情況 (蘇木精-伊紅染色，×200) 2a為假手術(shù)組，2b為模型組，2c為達(dá)格列凈組

2.4各組兔心肌組織凋亡情況比較 假手術(shù)組、模型組、達(dá)格列凈組凋亡指數(shù)分別為(10.0±0.9)%、(42.4±1.5)%、(28.6±1.2)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 014.544，P<0.001),與假手術(shù)組相比，模型組與達(dá)格列凈組凋亡指數(shù)均增加(P<0.01)，而與模型組相比，達(dá)格列凈組凋亡指數(shù)降低(P<0.01)。在模型組中檢測(cè)到大量的凋亡細(xì)胞，而達(dá)格列凈組的心肌中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見(jiàn)圖3。

3 討 論

再灌注治療對(duì)于ST段抬高型急性心肌梗死患者是一種非常重要的治療手段，但同時(shí)也是一把“雙刃劍”。當(dāng)缺血心肌組織再次獲得血液灌注時(shí)，可為缺血心肌細(xì)胞提供必要的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。然而，臨床上一些患者在恢復(fù)血液灌注后器官或組織的缺血性損傷并沒(méi)有減少或恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重心肌損傷[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和達(dá)格列凈組心肌組織蘇木精-伊紅染色均有明顯的病理改變，表明心肌缺血再灌注過(guò)程加劇了心肌損傷。

為了緩解缺血再灌注損傷，Murry等[13]首先提出了缺血預(yù)處理的概念，其可有效減少缺血再灌注損傷。隨后Zhao等[14]提出缺血后處理的方法，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，缺血預(yù)處理和缺血后處理均可減小梗死面積，改善心功能[15-17]。然而，缺血預(yù)處理和缺血后處理應(yīng)在創(chuàng)傷的前提下進(jìn)行，因此，在臨床上并沒(méi)有推行。藥理預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)單，是一種可行的臨床治療方法。已有研究只能說(shuō)明達(dá)格列凈對(duì)MIRI合并糖尿病大鼠心肌具有一定的保護(hù)作用[18-19]，而對(duì)不合并糖尿病的MIRI模型的研究較為少見(jiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)與人心肌缺血再灌注相似的、比較成熟的、可重復(fù)的、短實(shí)驗(yàn)周期的兔心肌缺血再灌注模型，觀察達(dá)格列凈預(yù)處理對(duì)MIRI心肌的影響。

達(dá)格列凈是一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑，被廣泛用于心血管和腎臟疾病的細(xì)胞保護(hù)[20-22]。血清hs-cTnT是心肌損傷時(shí)具有高靈敏度和特異度的血清學(xué)指標(biāo)，即使是細(xì)微的心肌損傷變化也能檢測(cè)出其表達(dá)[23]。本研究結(jié)果中，結(jié)扎后40 min、再灌注120 min時(shí)，達(dá)格列凈組血清hs-cTnT均顯著低于模型組，在一定程度上證實(shí)了達(dá)格列凈對(duì)MIRI的治療作用。目前有關(guān)達(dá)格列凈對(duì)心肌細(xì)胞抗凋亡作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，達(dá)格列凈組心肌中的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與以往的研究一致[24]。因此，認(rèn)為達(dá)格列凈對(duì)心肌細(xì)胞有抗凋亡作用。

綜上所述，達(dá)格列凈可以減輕MIRI，對(duì)受損的心肌有保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)僅局限于對(duì)心肌結(jié)構(gòu)、心肌損傷特異性標(biāo)志物及細(xì)胞凋亡影響的探討，關(guān)于達(dá)格列凈對(duì)MIRI心肌的保護(hù)作用及具體機(jī)制通路有待進(jìn)一步研究。

注：TUNEL為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記