張賓良，王文波，趙哲

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，哈爾濱 150001)

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)衍生物已被研究并應用于骨組織工程及再生醫(yī)學?，F(xiàn)有的PRP衍生物制劑主要有PRP、富血小板纖維蛋白及血小板裂解液(platelet lysate，PL)。早在20世紀70年代，就有文獻報道了關(guān)于PL的研究[1]。PL可通過將密度梯度離心后獲得的血小板提取物進一步凍融裂解而獲得[2]，其作為新型的血小板衍生物制劑，含有纖維蛋白原、黏附性血漿蛋白及豐富的生長因子，被認為能夠促進組織的增生、修復和愈合。近年來，有關(guān)PL的研究非常廣泛，目前其已被應用于臨床多學科疾病的治療，如骨科、口腔科、眼科、頜面外科、燒傷科、神經(jīng)外科及血液科等，其中以骨科為多。與PRP相比，PL在制備、組分、臨床使用等方面更具優(yōu)勢。由于PL具有獨特的生物學效用，其在骨科領域主要應用于骨損傷、運動損傷及皮膚軟組織損傷等疾病的治療，且已取得較理想的臨床效果。雖然PL已廣泛應用于骨科領域，但其作用于骨科相關(guān)疾病的具體作用機制和療效還需進一步研究、探討和驗證?，F(xiàn)就PL在骨科常見疾病中的研究現(xiàn)狀及進展予以綜述，以為臨床治療骨科常見疾病提供經(jīng)驗和參考。

1 PL中主要的生長因子

生長因子是傷口愈合、神經(jīng)修復、血管生成和骨再生的必要物質(zhì)。PL中的生長因子主要包括血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等。其中，PDGF是PL中最重要的生長因子，其可促進多種細胞的生長和增殖，如間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞[3-4]。此外，PDGF還能趨化巨噬細胞和中性粒細胞遷移到炎癥部位，促進軟組織及傷口愈合[5]。TGF-β參與調(diào)節(jié)MSCs、成纖維細胞的增殖以及成骨細胞的分化和遷移，刺激結(jié)締組織再生，促進血管生成，促進細胞外基質(zhì)和骨基質(zhì)的合成[4]。VEGF刺激內(nèi)皮細胞和成骨細胞的遷移和增殖，促進骨形成、骨愈合，參與血管生成[3]，促進基質(zhì)金屬蛋白酶的合成及單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的趨化。EGF促進傷口部位上皮細胞、成纖維細胞的有絲分裂和遷移，促進血管生成。IGF可調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化和遷移，促進血管生成，刺激膠原蛋白的產(chǎn)生，IGF-1可抑制白細胞介素-1β誘導的炎癥反應。FGF以內(nèi)分泌和旁分泌的方式參與傷口愈合、血管生成、軟組織再生及骨再生。BMPs有助于淋巴細胞的發(fā)育和活性、自然殺傷細胞的成熟和分化，也有助于骨及軟骨的形成、骨折的修復和血管的生成[6]。

PL中生長因子的濃度與血小板濃縮物中的血小板計數(shù)呈正相關(guān)，其主要生長因子的近似含量見表1[7]。生長因子的種類、濃度、組合不同，產(chǎn)生的作用也有差異。如PDGF-BB和TGF-β均可抑制FGF的血管生成特性，低濃度的PDGF、VEGF、FGF、TGF-β、EGF生物活性降低[5]，高濃度的FGF、TGF-β和PDGF-BB抑制細胞增殖和傷口閉合，F(xiàn)GF、EGF、TGF-β、PDGF、IGF-1對VEGF及其血管生成特性有正向調(diào)控作用，VEGF與PDGF聯(lián)合使用對MSCs遷移具有協(xié)同促進效應，VEGF、FGF和PDGF-BB聯(lián)合使用對骨折愈合更有利，F(xiàn)GF與BMPs在骨再生中具有協(xié)同作用。

表1 PL中主要生長因子的近似含量

2 PL替代胎牛血清作為體外培養(yǎng)基添加劑的相關(guān)研究

胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)是最常用的體外培養(yǎng)基添加劑，但存在動物病原傳播和動物蛋白向宿主轉(zhuǎn)移的風險。有研究表明，人上皮細胞在FBS中會出現(xiàn)生長受限的情況[8]。而PL去除了血小板膜等抗原成分，自體來源，彌補了FBS在生物安全性方面的不足，同時生產(chǎn)成本低。多項體外實驗結(jié)果顯示，PL可促進干細胞的體外擴增、分化[9-11]。有學者將CD34臍帶血干細胞與骨髓MSCs分別共培養(yǎng)在含有PL和FBS的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)兩種干細胞均能增殖和分化為紅細胞，但在基因表達和表面標志物表達方面，PL更具優(yōu)勢[9]。與FBS培養(yǎng)的人MSCs相比，用人PL培養(yǎng)的人MSCs呈梭形細胞形態(tài)，細胞增殖指數(shù)更高，但CD標志物相似，分化譜系(骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞)無明顯差異；此外，人PL在促進人MSCs的黏附、存活和增殖方面與FBS一樣有效[10]。還有學者認為，儲存時間超過4個月的濃縮血小板生產(chǎn)的人PL仍能有效支持MSCs的增殖和成骨分化[11]。在體外促進軟骨細胞增殖方面，人PL優(yōu)于FBS[8]。與FBS相比，5%和10%的PL能夠維持軟骨細胞分化相關(guān)標志物的基因表達，且添加5% PL的培養(yǎng)基更有利于軟骨細胞的增殖和分化[12]。

3 PL在骨科常見疾病中的應用

PL具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化和修復作用。由于其對肌腱組織以及骨組織的特殊效用，近年來，PL已逐步應用于臨床疾病的治療。目前，國內(nèi)外開展了多項PL在不同肌腱組織以及骨組織損傷相關(guān)疾病中的研究。

3.1肌腱損傷

3.1.1肱骨外上髁炎 肱骨外上髁炎是肱骨外上髁伸肌總腱起點處的慢性炎癥，多由勞損導致，主要表現(xiàn)為患側(cè)肘關(guān)節(jié)外側(cè)疼痛，用力握拳、屈腕時疼痛加重。其保守治療包括口服藥物(如非甾體抗炎藥)、局部封閉、康復理療等。手術(shù)治療分為關(guān)節(jié)鏡和開放手術(shù)。部分患者治療后療效不佳或復發(fā)，發(fā)展為難治性肱骨外上髁炎。近年來，PL作為PRP衍生物被認為在肱骨外上髁炎的治療中有效。Scudeller等[13]首次報道了PL用于治療肱骨外上髁炎，與不采取干預措施相比，PL治療后肘部疼痛緩解更明顯。目前，國內(nèi)外關(guān)于單純使用PL治療肱骨外上髁炎的近期和遠期預后效果均尚可。Tan等[14]發(fā)現(xiàn)，連續(xù)3周注射PL的肱骨外上髁炎患者，受損組織再生，治療1個月后肘部恢復正常功能，治療1年肘部功能正常且疼痛可耐受。隨后，有學者提出體外沖擊波聯(lián)合PL治療肱骨外上髁炎。體外沖擊波聯(lián)合PL局部注射治療難治性肱骨外上髁炎能有效緩解疼痛，改善患者的肘關(guān)節(jié)功能同時安全可靠。嚴偉等[15]采用體外沖擊波聯(lián)合PL局部注射治療難治性肱骨外上髁炎患者發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，治療后患者的疼痛視覺模擬評分顯著降低，Mayo肘關(guān)節(jié)功能評分顯著升高，病變范圍明顯縮小。因此，與單純使用PL相比，體外沖擊波聯(lián)合PL能夠產(chǎn)生更好的治療效果，改善預后。但是單純采用PL治療肱骨外上髁炎治療周期的選擇，還依賴于更大型的前瞻性研究以及權(quán)威指南的發(fā)布。

3.1.2跟腱炎 跟腱炎是臨床最常見的足踝部損傷之一，可分為止點性跟腱炎(累及跟骨結(jié)節(jié)跟腱附著點)和非止點性跟腱炎(發(fā)生在跟腱附著點近端2～6 cm)。跟腱炎主要表現(xiàn)為跟腱處疼痛、腫脹、僵硬，活動后癥狀加重，多采用非手術(shù)治療如口服藥物、PRP注射、小劑量糖皮質(zhì)激素封閉。近年，PL逐漸運用于跟腱炎的治療。在一項大鼠膠原酶跟腱損傷的動物實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)在含有PL的培養(yǎng)基中擴增的人MSCs可以更好地支持跟腱組織愈合[16]。傳統(tǒng)跟腱炎保守治療(如PRP注射)的療效較為理想。已有臨床試驗表明，PL與PRP治療跟腱炎的療效相當，且PL的應用前景更好。劉廣亞等[17]發(fā)現(xiàn)與注射PRP組相比，PL組足跟部疼痛明顯緩解，足踝部功能顯著提高，跟腱病損區(qū)病變改善。在跟腱損傷后，局部應用PL可有效加快其愈合進程，增加肌腱修復后的生物力學強度，促進跟腱早期修復。

3.1.3肩袖損傷 在創(chuàng)傷、肌腱退變、肩峰下撞擊等作用下，肩袖肌腱易發(fā)生撕裂，是肩痛和肩關(guān)節(jié)相關(guān)殘疾的主要原因。組成肩袖的肌腱主要由Ⅰ型膠原纖維組成，BMP-2可顯著促進Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，對腱細胞的作用呈劑量依賴性。肩袖肌腱損傷后，腱骨的愈合過程緩慢，從而延緩治療進程，降低預后。一項關(guān)于小鼠肩袖撕裂的動物實驗表明，BMP-4可能通過促進纖維軟骨附著點礦化來促進腱骨附著點損傷的愈合，降低復發(fā)性損傷的風險[18]，這對于肩袖修補術(shù)后腱骨愈合至關(guān)重要。Yonemitsu等[19]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2可增強肌腱愈合反應，促進更成熟的肌腱樣組織形成，修復組織形態(tài)，改善肩袖生物力學。除了BMPs和FGF外，TGF-β和BMPs通過介導細胞外基質(zhì)合成和細胞分化積極參與肌腱修復。有文獻報道，PL還可保持脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的細胞活力，激發(fā)ADSCs的體外肌腱分化潛能，同時促進肌腱發(fā)育和分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis等的表達，促進腱骨愈合，改善愈合質(zhì)量，獲得較好的生物力學性能[20]。由于PL含有纖維蛋白原、黏附性血漿蛋白及大量的生長因子，可以促進組織的增生、修復和愈合，在肌腱損傷，尤其是肩袖損傷中有獨特的生物學效能。目前，關(guān)于PL治療肩袖損傷的文獻及臨床運用有限，需要更多高質(zhì)量的研究論證PL在肩袖損傷修復方面的有效性。

3.2軟骨及骨組織損傷

3.2.1膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA) KOA是40歲以上人群中最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，是引起中老年患者膝關(guān)節(jié)疼痛和功能殘疾的重要原因。KOA晚期以手術(shù)治療為主，早、中期以保守治療為主。近年，PL作為第3代富血小板技術(shù)產(chǎn)物在KOA治療中受到廣泛關(guān)注。PL治療KOA的作用機制包括：①PL可增加透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，同時保護軟骨細胞免受滑膜細胞來源的炎癥介質(zhì)的侵害[21]；②負載PL的復合水凝膠可抑制白細胞介素-1β誘導的軟骨細胞的炎癥反應和去分化[22]；③PL對軟骨的保護作用可能與調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸合酶-1的表達有關(guān)[23]；④PL通過調(diào)節(jié)長鏈非編碼RNA H19/miR-29b-3p/SOX9軸誘導人臍帶MSCs向軟骨細胞分化[24]。多項臨床試驗表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PL治療KOA的短期療效理想。如嚴偉等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PL的患者，治療后疼痛及僵硬程度減輕，關(guān)節(jié)功能受限程度降低，關(guān)節(jié)活動度和穩(wěn)定性得到一定程度的恢復。侯燕等[26]比較關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PL(治療組)和透明質(zhì)酸鈉(對照組)治療KOA的療效發(fā)現(xiàn)，連續(xù)治療1個月后治療組患膝的西安大略和麥克馬斯特大學骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于對照組，美國膝關(guān)節(jié)協(xié)會評分和膝關(guān)節(jié)Lysholm評分均高于對照組。鞠昌軍等[27]通過對比研究發(fā)現(xiàn)，PL治療KOA能夠取得與PRP同樣的治療效果且均優(yōu)于玻璃酸鈉，且不良反應發(fā)生率低。盡管這些研究驗證了PL在治療KOA中的獨特優(yōu)勢，然而關(guān)于PL治療KOA的長期療效以及聯(lián)合其他藥物治療的療效有待進一步研究驗證。Tyrnenopoulou等[28]將PL注射到骨關(guān)節(jié)炎馬的關(guān)節(jié)內(nèi)，短期內(nèi)馬恢復正?；顒樱俗阍u分改善，然而在注射后1年所有馬均恢復到了最初的跛行程度。鄭傳睿等[29]發(fā)現(xiàn)，PL聯(lián)合ADSCs可以提高KOA大鼠的疼痛閾值，修復軟骨損傷，且作用效果優(yōu)于PL和ADSCs單獨使用。甚至有學者發(fā)現(xiàn)，在三維軟骨細胞再分化過程中，PL的存在可顯著抑制膠原和糖胺聚糖的合成[30]，這一發(fā)現(xiàn)使關(guān)節(jié)內(nèi)注射PL治療KOA受到質(zhì)疑。目前，臨床是否使用PL治療KOA仍具有廣泛爭議，尚未達成定論。因此PL治療KOA的不良反應，以及患者能否獲得滿意的長期預后，仍有待大型臨床試驗的進一步驗證。

3.2.2骨不連 骨不連是指骨折后至少9個月，連續(xù)3個月沒有進一步愈合傾向，經(jīng)臨床或X線證實愈合停止。5%～10%的長骨干骨折患者愈合受損，最終可導致骨不連。骨不連是骨科醫(yī)師面臨的重要難題。目前治療骨不連的“金標準”是使用自體松質(zhì)骨移植物。近年來，PL作為骨不連的生物治療方式之一受到學者的關(guān)注。PL通過提供生長因子，促進有絲分裂，增強堿性磷酸酶的活性，促進軟骨和骨基質(zhì)形成，進而促進骨折的愈合。在體外條件下,單純 5%的PL可以誘導人臍帶MSCs向成骨細胞定向分化。靜息或極慢分裂的成骨細胞在PL刺激后表現(xiàn)出快速增殖，而去除PL后則恢復到無增殖或極慢分裂狀態(tài)[31]。Xue等[32]將富含人PL的無血清培養(yǎng)基擴增的臍帶MSCs經(jīng)靜脈注射到1例肱骨骨不連合并橈神經(jīng)損傷的患者體內(nèi)，注射60 d后，臨床進展良好，患者神經(jīng)反射存在，肌張力和肌力增強，X線顯示骨折間隙消失，肌電顯示神經(jīng)傳導速度增加，隨訪期間沒有觀察到不良反應。為評估MSCs聯(lián)合PL植入治療人長骨不連的安全性，Labibzadeh等[33]納入18例長骨不連患者，均接受MSCs聯(lián)合PL植入治療，結(jié)果顯示治療期間患者耐受性良好，4例痊愈患者X線顯示骨愈合。目前，改善創(chuàng)傷或腫瘤切除術(shù)后骨再生的方法包括使用自體移植骨或可替代生物材料，以及使用成骨誘導生長因子和(或)成骨細胞(如MSCs)。而PL憑借其獨特的優(yōu)勢可成為一種有效的替代補充方法。已有試驗證明，PL可以快速有效誘導骨髓MSCs增殖，以及向成骨細胞分化[34]。同時，PL在臨床研究中也具有良好的體內(nèi)修復骨組織的潛力。目前，PL聯(lián)合多種生物學材料的開發(fā)(如PL涂層支架)加快了基于PL的骨再生治療的臨床轉(zhuǎn)化。

3.2.3骨缺損、骨再生 骨缺損由創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、外科手術(shù)等造成。為研究PL在骨組織工程中的作用，學者進行了骨再生和骨缺損的相關(guān)動物實驗研究、體外研究及臨床試驗。Bolte等[35]將分化前的MSCs與PL聯(lián)合注入小鼠2 mm股骨缺損處，經(jīng)過6周的觀察發(fā)現(xiàn)，骨體積、缺損愈合程度和可測量的生物力學剛度明顯提高。Centeno等[36]研究發(fā)現(xiàn)，PL能夠明顯促進骨損傷部位的骨再生，同時治療期間無不良反應發(fā)生。PL可作為骨移植植入材料的輔助藥物修復骨缺損，促進骨長入。雖然可注射的磷酸鈣骨水泥已被用作自體骨移植的有效替代品，具有微創(chuàng)植入和修復組織缺損的優(yōu)勢，但其生物降解性較低，缺乏足夠的生化信號來促進骨愈合和重塑。在一項摻有PL的磷酸鈣骨水泥對大鼠顱骨缺損骨愈合能力的研究中，學者發(fā)現(xiàn)與摻入透明質(zhì)酸微球相比，摻入PL的磷酸鈣骨水泥更能誘導骨愈合，同時增加骨水泥的降解[37]。此外，PL也被認為能增強某些金屬材料的作用，如多孔鉭。多孔鉭金屬材料表面凹凸不平，掃描電鏡下可見細小顆粒構(gòu)成的蜂窩狀微孔結(jié)構(gòu)。經(jīng)過PL修飾的多孔鉭與細胞結(jié)合更緊密，細胞偽足伸展更充分，細胞外基質(zhì)分泌更旺盛，可促進軟組織與金屬植入物的融合，同時能防止細菌入侵、組織炎癥和生物醫(yī)學金屬植入物的失效。胡介宇[38]發(fā)現(xiàn)，PL可促進新骨長入多孔鉭內(nèi)部孔隙，并加速新骨成熟。對于PL的應用時限及頻次，尚無統(tǒng)一標準，有報道指出，長期應用PL會抑制堿性磷酸酶活性以及基質(zhì)的礦化[39]，對成骨細胞分化形成負面干擾。

3.3傷口和潰瘍愈合 傷口愈合是一個動態(tài)的過程，包括炎癥、增殖和重塑，高度依賴于炎癥細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和角質(zhì)細胞的功能，最終恢復傷口的完整。除了生長因子外，PL中還存在纖維蛋白原和黏附性血漿蛋白，為細胞定植和組織再生提供強有力的纖維蛋白基支架，有利于受損組織的愈合。PL能顯著刺激大鼠原代皮膚成纖維細胞增殖，增加分裂期的細胞比例，促進細胞遷移和傷口愈合，對大鼠慢性皮膚潰瘍有積極作用[40]。同時，用人PL體外擴增的皮膚成纖維細胞能保持正常的核型和細胞標志物的表達。PL凝膠是將單采血小板裂解后獲得的液體成分按比例加入凝血酶、鈣離子等激活物，使其凝結(jié)為膠狀的生物材料。PL凝膠內(nèi)含有PDGF、TGF-β等多種生長因子，具有良好的黏附性，能夠有效地進行炎癥調(diào)節(jié)、組織修復。張進進等[41]發(fā)現(xiàn)，糖尿病潰瘍患者采用清創(chuàng)換藥聯(lián)合PL凝膠治療后的創(chuàng)面在愈合時間、創(chuàng)面愈合率、臨床療效方面均優(yōu)于僅進行清創(chuàng)換藥治療。此外，PL中的EGF在傷口處的累積可縮短糖尿病足的愈合時間。近年來，除了有PL治療糖尿病足的研究外，還有用PL治療甲氨蝶呤引起口腔潰瘍的報道。甲氨蝶呤是治療類風濕關(guān)節(jié)炎最常用的抗風濕藥物，目前針對甲氨蝶呤引起的口腔潰瘍還沒有十分有效的方案，PL在口腔潰瘍治療方面提供了新選擇。一項隨機對照臨床試驗中，與丙酸氯倍他索相比，人PL在減輕甲氨蝶呤引起的類風濕關(guān)節(jié)炎患者口腔潰瘍的疼痛和臨床癥狀方面具有更好的效果，人PL治療后潰瘍面積縮小，數(shù)量減少，且未觀察到不良反應，治療有效性顯著[42]。

3.4神經(jīng)根性疼痛 腰椎間盤突出是導致腰背痛和腿部放射性疼痛的常見原因，影響患者的行為能力，其治療包括康復鍛煉、藥物、硬膜外類固醇注射、手術(shù)等。近年來，硬膜外注射PL成為一種新的治療選擇。人PL提供重要的神經(jīng)修復因子尤其是腦源性生長因子，下調(diào)促炎基因、降低活性氧水平、減少突觸蛋白的丟失[39]。PL中的肝細胞生長因子作為疼痛拮抗劑和環(huán)加氧酶1下調(diào)因子，可以減輕疼痛和炎癥。PL還可以通過消耗白細胞和血小板膜顆粒來阻止炎癥物質(zhì)在注射部位的積聚，同時啟動或加速突出的腰椎間盤物質(zhì)的吸收，實現(xiàn)椎管的減壓。Centeno等[43]將PL注入腰硬膜外腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)，患者疼痛緩解，腰部活動功能改善。Rawson[44]也報道了通過硬膜外注射PL成功治療2例有癥狀的腰椎間盤突出癥患者。另有研究表明，人PL復合ADSCs能促進軸突的生長，顯著提高ADSCs的神經(jīng)營養(yǎng)能力，進而促進神經(jīng)修復[45]。目前有關(guān)PL治療神經(jīng)根性疼痛這一方案，國內(nèi)外僅有少量報道，其療效仍需醫(yī)療中心開展大型臨床試驗驗證。

4 小 結(jié)

PL作為第3代富血小板技術(shù)產(chǎn)物，含有大量的生長因子，其不僅去除了血小板膜和其他細胞殘片(如白細胞)，降低了免疫原性，生物安全性高，不良反應發(fā)生率低，且制備工藝相對簡單，生產(chǎn)成本較低。PL可促進細胞增殖、干細胞分化和組織修復，對骨與軟骨損傷、肌腱病等具有一定的治療作用，具有廣闊的應用前景。但PL的治療效果與PL中生長因子的種類、濃度以及治療頻次、制備工藝、患者自身情況等多種因素有關(guān)。目前關(guān)于PL治療骨科疾病的臨床試驗報道有限，其應用的有效性仍需更多高質(zhì)量、大規(guī)模的臨床試驗、基礎研究論證。