朱琳超 孫菊琴 姚軼敏

再生障礙性貧血（aplastic anemia,AA）是一種由免疫介導(dǎo)的造血干細(xì)胞和造血微環(huán)境受損而導(dǎo)致骨髓造血衰竭的惡性血液病。AA的特點(diǎn)是骨髓造血干細(xì)胞增殖減少，導(dǎo)致外周血細(xì)胞減少，以貧血、出血和感染為主要臨床表現(xiàn)。輸血在AA患者的治療中發(fā)揮著重要作用，但長期輸血一方面會(huì)造成嚴(yán)重鐵過載，進(jìn)而損傷組織，最終導(dǎo)致內(nèi)臟器官功能障礙，其病程和預(yù)后與鐵過載程度有關(guān)[1-2]，另一方面可能造成輸血無效。有研究發(fā)現(xiàn)，β-地中海貧血患者由于長期輸血導(dǎo)致鐵過載，進(jìn)一步損傷組織器官功能從而顯著影響疾病病程發(fā)展[3]。鐵是一種必需的元素，在生命過程中發(fā)揮著重要作用，如DNA合成、能量代謝和氧氣運(yùn)輸，然而，過量的鐵會(huì)通過芬頓（Fenton）反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species,ROS）損傷細(xì)胞[4-6]。因此，維持鐵水平在正常范圍非常重要。近年來，鐵過載與免疫系統(tǒng)的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，免疫因子的失調(diào)增加了人體內(nèi)鐵過載的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載可以通過增加ROS來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能[9]。另外，輸血無效在依賴輸血的血液病患者中非常常見，多數(shù)由免疫因素所導(dǎo)致[10]。筆者回顧了AA患者的臨床資料、血清鐵蛋白水平、T淋巴細(xì)胞亞群、輸注療效等參數(shù)，旨在探討不同輸注療效對(duì)鐵過載AA患者T淋巴細(xì)胞亞群的影響，以及T淋巴細(xì)胞與鐵過載程度的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2019年1月至2021年5月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院AA患者158例。根據(jù)血常規(guī)、骨髓檢查和骨髓活檢確診，符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）中AA診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，所有患者均未行造血干細(xì)胞移植治療，臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查排除感染性疾病、免疫性疾病、骨髓移植和其他造血系統(tǒng)疾病。以鐵蛋白＞1 000 μg/L定義為鐵過載[12]。輸血患者均符合臨床輸血指征（Hb＜70 g/L），輸注的紅細(xì)胞均由浙江省血液中心提供，所有納入患者輸注去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞后24 h內(nèi)復(fù)查Hb。紅細(xì)胞輸注效果的判定：按輸注協(xié)作組提出的實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)[13]，Hb 升高預(yù)期值（g/L）=[供者 Hb（g/L）×輸入量（L）/患者體重（kg）×0.085（L/kg）]×90%，其中輸入量以全血量為標(biāo)準(zhǔn)，紅細(xì)胞制劑折算為對(duì)應(yīng)全血量；90%為檢驗(yàn)誤差。Hb升高值未達(dá)到預(yù)期值的80%為輸注無效，Hb升高值達(dá)到或超過預(yù)期值的80%為輸注有效，根據(jù)輸注是否有效分為輸注有效組82例和輸注無效組76例。輸注有效組男 33 例，女 49 例，年齡 15～82（47.2±16.4）歲；其中鐵過載44例，非鐵過載38例。輸注無效組男28例，女 48 例，年齡 13～80（42.6±13.5）歲；其中鐵過載 41 例，非鐵過載35例。兩組患者性別、年齡及鐵過載患者比例的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑與儀器 全自動(dòng)血液分析儀為Beckman Coulter Gen.S LH780全自動(dòng)血液分析儀及血常規(guī)配套試劑。流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter FACSCantoⅡ五色流式細(xì)胞儀，單克隆抗體Cyto-STAT tetraCHROME CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-PE/CD8-ECD（批號(hào)：6607073，規(guī)格 0.5 ml），單色鼠抗人單克隆抗體CD25-FITC（批號(hào)：IM1026，規(guī)格：0.5 ml）均購自美國 Beckman Coulter公司，Abbott C1600全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑購自美國Abbott公司。

1.3 方法

1.3.1 血常規(guī)檢測(cè) 于清晨采集受檢者靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，采用Beckman Coulter Gen.S LH780全自動(dòng)分析儀檢測(cè)血常規(guī)，于2 h內(nèi)上機(jī)完成檢測(cè)。

1.3.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 于清晨采集受檢者靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，標(biāo)本在采集后6 h內(nèi)染色、上機(jī)檢測(cè)。取流式管，加入10 μl不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體，加入外周血100 μl混勻，室溫下避光放置20 min，加入溶血素2 ml，室溫下放置20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 ml PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，500 μl PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群水平，包括 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD4＋CD25＋等 T 淋巴細(xì)胞。

1.3.3 血清鐵蛋白檢測(cè) 于清晨采集受檢者靜脈血4 ml于促凝管中，等血液凝固后3 500 r/min離心5 min后取血清，采用Abbott C1600全自動(dòng)生化分析儀于6 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；T淋巴細(xì)胞與鐵過載程度的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同輸注療效患者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較 兩組患者T淋巴細(xì)胞亞群比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 不同輸注療效患者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 輸注有效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較 鐵過載者CD3＋T淋巴細(xì)胞比例低于非鐵過載者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05），見表2。

表2 輸注有效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較

2.3 輸注無效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 鐵過載者CD3＋T淋巴細(xì)胞比例低于非鐵過載者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見表3。

表3 輸注無效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 不同輸注療效患者CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白的相關(guān)性分析 全體AA患者CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白無相關(guān)性（r=0.095，P＞0.05），見圖1。紅細(xì)胞輸注有效患者，CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.305，P＜0.05），見圖2。紅細(xì)胞輸注無效患者，CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白無相關(guān)性（r=0.024，P＞0.05），見圖3。

圖1 全體AA患者CD3+T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白相關(guān)性的散點(diǎn)圖

圖2 輸注有效組患者CD3+T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白相關(guān)性的散點(diǎn)圖

圖3 輸注無效組患者CD3+T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白相關(guān)性的散點(diǎn)圖

3 討論

AA是血液系統(tǒng)常見疾病，治療依賴長期輸注，輸注一個(gè)單位紅細(xì)胞含有大約100 mg鐵，但鐵排泄的生理機(jī)制尚不清楚[14-15]。輸注的衰老紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬，不穩(wěn)定的細(xì)胞鐵被釋放到血漿中并與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，當(dāng)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合飽和后，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵在不同器官積累導(dǎo)致鐵過載，引起一系列臨床并發(fā)癥[16-17]。雖然鐵過載對(duì)實(shí)質(zhì)器官有明顯的影響，但鐵過載對(duì)造血系統(tǒng)的影響尚未闡明，其確切機(jī)制尚不清楚，越來越多的臨床證據(jù)表明，鐵過載對(duì)骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）和AA患者的造血功能有抑制作用，鐵螯合治療可以改善這一情況[18-19]。免疫異常是造成AA造血功能異常的主要原因，T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)，CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量與比值改變，導(dǎo)致免疫功能發(fā)生改變，其免疫作用以造血細(xì)胞為靶細(xì)胞，最終造成全血細(xì)胞減少[20]。近年來，鐵過載與機(jī)體免疫的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)鐵過載可通過升高ROS損傷骨髓造血功能，包括直接對(duì)造血干細(xì)胞以及間接對(duì)造血支持間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能損傷[21]。因此，一方面AA患者長期輸注導(dǎo)致鐵過載，鐵過載對(duì)造血又有抑制作用，另一方面長期輸注導(dǎo)致輸注無效，這已成為臨床一大難題。本研究分析免疫因素、輸注療效和鐵過載3者之間的關(guān)系，初步探討不同輸注療效對(duì)鐵過載AA患者T淋巴細(xì)胞亞群的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，輸注有效組與輸注無效組的T淋巴細(xì)胞亞群差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示輸注療效對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群影響不大，因此課題組進(jìn)一步對(duì)紅細(xì)胞輸注療效進(jìn)行分組，分別分析鐵過載對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響，輸注有效組與輸注無效組結(jié)果均顯示，鐵過載患者CD3+T淋巴細(xì)胞比例較非鐵過載均顯著降低。Guan等[20]研究MDS患者發(fā)現(xiàn)鐵過載組T淋巴細(xì)胞亞群紊亂，CD3+T淋巴細(xì)胞比例降低，同時(shí)淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，這與本研究結(jié)果一致。鐵過載促發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加的ROS通過多條信號(hào)通路，如p38 MAPK/p53和p21 WAF1/Cip1/Sdi1通路，對(duì)T淋巴細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，影響免疫功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。AA患者由于鐵過載導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，促進(jìn)T細(xì)胞衰老和凋亡增加，從而顯著降低T細(xì)胞比例?；谝陨辖Y(jié)果，筆者進(jìn)一步將試驗(yàn)對(duì)象分為3組，即AA患者、輸注有效的AA患者和輸注無效的AA患者，分別分析CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)輸注有效組CD3＋T淋巴細(xì)胞與鐵蛋白呈負(fù)相關(guān)，其他兩組與鐵蛋白無相關(guān)性，提示鐵過載對(duì)輸注有效的AA患者CD3＋T淋巴細(xì)胞影響較大。

綜上所述，輸注有效的AA患者鐵過載對(duì)CD3＋T淋巴細(xì)胞影響較大，兩者呈負(fù)相關(guān)，內(nèi)在免疫因素會(huì)影響輸注療效，但輸注療效對(duì)鐵過載和T淋巴細(xì)胞的相互作用起何作用的報(bào)道較少。筆者將進(jìn)一步研究鐵過載與T淋巴細(xì)胞相互作用的機(jī)制，以及輸注療效影響鐵過載與T淋巴細(xì)胞關(guān)系的內(nèi)在機(jī)制，為臨床治療AA患者鐵過載導(dǎo)致的免疫功能紊亂以及減少輸注無效提供理論依據(jù)。