占日新，華銘，金燕

（杭州市第九人民醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

0 引言

胰島素抵抗（insulin resistance,IR）是指各種原因使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，常伴有高胰島素血癥，易導(dǎo)致代謝綜合征和2型糖尿病。內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞也對(duì)胰島素敏感，因?yàn)楦呙芏鹊囊葝u素受體也存在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中，胰島素具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在心血管系統(tǒng)也表現(xiàn)其作用，如胰島素的生理濃度可以調(diào)節(jié)血管張力和維持血管內(nèi)皮的完整性。其作用機(jī)制是胰島素通過IRS-1/RAS/MAPK/ET-1和IRS-1/PI3K/Akt/NO間平衡協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[1]。但高血糖，高脂血癥和高胰島素血癥等引起的病理狀態(tài)可以打破兩條通路間的平衡，出現(xiàn)IR和內(nèi)皮功能失?，F(xiàn)象，從而誘發(fā)心血管疾病，該病包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和冠心病等[2]。有研究發(fā)現(xiàn)33mmol/L高糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR，吡格列酮和羅格列酮激活PPARγ后能顯著改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR癥狀[3]，替米沙坦能夠部分激動(dòng)PPARγ作用[4]。Myojo M等[5]研究發(fā)現(xiàn)0.1μmol/L、1μmol/L或10μmol/L替米沙坦治療人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后可顯著提高了eNOS的磷酸化水平，以濃度依賴的方式增加。本實(shí)驗(yàn)從替米沙坦對(duì)高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素敏感性的影響展開研究。

1 材料

1.1 細(xì)胞株以及主要試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院），DMEM 培養(yǎng)基干粉（gibco）；替米沙坦（羅恩），NO、ET-1、IL-6及TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；MD-200-3 型電子天平（上海第三分析儀器廠）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BIO-RAD，美國）；超低溫冰箱（Sanyo，日本）；Eppendorf 加樣器（Eppendorf，德國）；生物樣品均質(zhì)機(jī)（法國BIRTIN，Precellys 24），生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SPC-150BZ），移液器（Eppendorf，Research）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)具體步驟

在細(xì)胞培養(yǎng)皿上均勻接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），隨機(jī)分為高糖組（HG）與替米沙坦處理組（HG+TM）共2組。HG組在含Glucose 33mmol/L的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h[3]。HG+TM組先在含33mmol/L Glucose的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后在含替米沙坦500μg/L[5]+Glucose 33mmol/L完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。按照上條件處理結(jié)束后，兩組細(xì)胞在含5.5mmol/L Glucose地DMEM（無血清）繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入終濃度為5mIU/L胰島素繼續(xù)培養(yǎng)10min，最后將兩組細(xì)胞上清液進(jìn)行收集，檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、NO及ET-1水平進(jìn)行比較。

2.2 檢測(cè)兩組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液NO水平

參照南京建成生物工程研究所NO檢測(cè)試劑盒的使用說明。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1～100μM）采用DMEM＋10%FBS；樣品采用已處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液，按照每孔50μl，將標(biāo)準(zhǔn)品及樣品加入在48孔板中；然后室溫中將Griess Reagent I加入各孔中；最后室溫中將Griess Reagent Ⅱ加入各孔中。用酶標(biāo)儀在540nm波長下測(cè)定吸光度。先把稀釋標(biāo)準(zhǔn)品吸光度與濃度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)兩組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液吸光度推算出NO 水平。

2.3 檢測(cè)兩組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液E T-1、TNF-α、IL-6水平

按照南京建成生物工程研究所ET-1、TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒里面步驟說明書實(shí)施雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體依次加入預(yù)先包被ET-1、TNF-α、IL-6抗體的包被微孔中，溫育后徹底洗滌完成后。最后用底物四甲基聯(lián)苯胺顯色，450nm測(cè)定吸光度，先做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)兩組樣品吸光度計(jì)算樣品ET-1、TNF-α、IL-6水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組HUVECs上清液NO、ET-1水平比較

與HG組相比，HG+TM組NO水平升高和ET-1水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=9.70、-5.82，P＜0.01）。血管內(nèi)皮細(xì)胞在Glucose 33mmol/L完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后可引起胰島素抵抗[3]，而胰島素的生理濃度可以調(diào)節(jié)血管血管張力和維持血管內(nèi)皮的完整性。其作用機(jī)制是胰島素通過IRS-1/RAS/MAPK/ET-1和IRS-1/PI3K/Akt/NO間平衡協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的[1]。該結(jié)果表明替米沙坦可顯著增加高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素敏感性，見表1。

表1 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

表1 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

注：與HG組比較，**P＜0.01。

3.2 兩組TNF-α、IL-6水平比較

與HG組相比，HG+TM組TNF-α、IL-6水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=-16.46、-4.68，P＜0.01）；表明替米沙坦可顯著降低高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、IL-6炎癥因子水平，如表2所示。

表2 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

表2 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

注：與HG組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

2型糖尿病（T2DM）的發(fā)病機(jī)制和IR的發(fā)生是由多種刺激因素引起的，特別是糖脂毒性、活性氧（ROS）的產(chǎn)生、各種轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)通路的激活以及各種促炎細(xì)胞因子水平的增加。在各種促炎細(xì)胞因子中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是最重要的促炎介質(zhì)之一，它與胰島素抵抗的發(fā)展和T2DM的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。TNF-α通過激活各種轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)組織特異性炎癥和參與ROS的生成。胰島素信號(hào)損害與TNF-α水平的升高通過絲氨酸磷酸化密切相關(guān)，而胰島素信號(hào)損害可引起IR，從而導(dǎo)致T2DM的發(fā)展?？筎NF-α治療策略已被開發(fā)以減少胰島素抵抗的發(fā)生率和T2DM的發(fā)展[6]。Akash MSH等研究發(fā)現(xiàn)，HepG2肝細(xì)胞中TNF-α下調(diào)后，有助于改善的胰島素刺激后的IRS-1磷酸化和胰島素反應(yīng)[7]。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種促炎細(xì)胞因子，通過控制分化、遷移、增殖和細(xì)胞凋亡，通過炎癥的產(chǎn)生，決定性地誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生和2型糖尿病T2DM的發(fā)病。IL-6通過誘導(dǎo)胰島素信號(hào)通路潛在抑制劑SOCS-3的表達(dá)，使胰島素受體和胰島素受體底物-1的磷酸化受損，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[8]。表明炎癥因子TNF-α、IL-6在IR中起到重要作用。吡格列酮和羅格列酮激活PPARγ后能顯著改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗癥狀[3]，而替米沙坦作為PPARγ部分激動(dòng)劑，有研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦通過激活PPARγ來改善心肌重構(gòu)[9]。替米沙坦具有部分PPARγ激動(dòng)作用，同時(shí)避免了PPARγ激動(dòng)劑（噻唑烷二酮類）的安全性問題。替米沙坦可能是一種替代治療方案，對(duì)糖尿病和高血壓有雙重好處，由此可見，替米沙坦通過部分PPARγ激動(dòng)活性抗糖尿病作用將成為新的糖尿病的藥物治療方案[10]。替米沙坦還可以抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷，表現(xiàn)為降低晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1和MCP-1水平[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦可使得33mmol/L高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞NO水平升高，TNF-α、IL-6、ET-1水平下降。結(jié)果提示，替米沙坦可增加高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素敏感性，其機(jī)制可能降低TNF-α、IL-6炎癥因子水平有關(guān)。替米沙坦對(duì)高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，有望用于預(yù)防糖尿病引起的血管病變。