董雙濤，霍乃蕊

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院宣傳統(tǒng)戰(zhàn)部，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

0 引言

對(duì)聚合草蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，比較不同的蛋白提取方法；并進(jìn)行蛋白的氨基酸組成分析和氨基酸評(píng)分，為聚合草的深加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料

聚合草葉采于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)；紫花苜蓿采于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站。

2 試驗(yàn)方法

2.1 聚合草干葉和鮮葉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)采用GB5009.5-2010第一法凱氏定氮法測(cè)定。

2.2 聚合草葉蛋白的提取

分別采用：TCA-丙酮沉淀法，SDS法及酚法，三種方法提取。

2.3 蛋白定量

采用Bradford（1976）方法，考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白顯色液組成：0.01%（w/v）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸。標(biāo)準(zhǔn)蛋白以牛血清白蛋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待分析蛋白溶液的0.1mL，10倍稀釋，加5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色液，混勻，放置5min，測(cè)其吸光度值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待分析蛋白液中蛋白的濃度。

2.4 蛋白質(zhì)提取率及蛋白提取物的純度計(jì)算

2.5 聚合草葉蛋白氨基酸組分分析

2.5.1 氨基酸組成測(cè)定方法

蛋白質(zhì)氨基酸組分分析采用GB/T 5009.124-2003標(biāo)準(zhǔn)，最低檢出限為10pmol。由于聚合草葉片中蛋白質(zhì)含量豐富，適于用本法進(jìn)行測(cè)定。

樣品處理：①色氨酸以4.2mol NaOH水解；②胱氨酸用過甲酸氧化法處理測(cè)定；③其余氨基酸以6mol HCl水解測(cè)定。

2.5.2 氨基酸評(píng)價(jià)方法

AAS 是指被測(cè)蛋白質(zhì)每克氮（或蛋白質(zhì)）中氨基酸量（mg）除以理想模式或參考蛋白質(zhì)中每克氮（或蛋白質(zhì)）中氨基酸量（mg）[1]。AAS測(cè)定按FAO[2]的方法進(jìn)行，AAS值代表了待測(cè)氨基酸與FAO/WHO模式中相應(yīng)氨基酸的接近程度[1]。

EAAI值顯示待測(cè)蛋白質(zhì)中所有必需氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)必需氨基酸的接近程度[1]。采用Pensflorida評(píng)價(jià)飼料蛋白原的方法測(cè)定，其公式為：

式中：aai為牧草某種必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)；

AAi為參比蛋白中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)；

n為計(jì)算中涉及的必需氨基酸數(shù)[3]。

3 結(jié)果與分析

3.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

按3.3方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 三種方法的蛋白提取率及蛋白提取物的純度

經(jīng)測(cè)定，聚合草干葉、鮮葉中的粗蛋白含量分別為24.3%，3.8%，等質(zhì)量葉片經(jīng)計(jì)算得得到的蛋白提取率和蛋白提取物的純度如表1所示。

表1 三種不同方法的蛋白提取率和蛋白提取物的純度

由表1知，酚法的蛋白提取物的純度是TCA-丙酮沉淀法和SDS法的10幾倍至20倍，由于TCA-丙酮沉淀法和SDS法提取的蛋白質(zhì)位于沉淀部分，而酚法位于上清液中，該結(jié)果也反映了TCA-丙酮沉淀法和SDS法提取的有效性，僅有極少量的蛋白質(zhì)殘存在上清液中。蛋白質(zhì)的提取率，三種方法均為鮮葉高于干葉，TCA-丙酮沉淀法要高5.31%、SDS法高14.39%、酚法則高22.19%。無(wú)論對(duì)于聚合草干葉還是鮮葉，酚法提取效果最佳，當(dāng)從鮮葉中直接提取時(shí)，提取率高達(dá)84.7%，蛋白提取物的純度為64.4%，干葉中的提取率為62.51%，蛋白提取物的純度為51.46%，SDS法次之，TCA-丙酮沉淀法最差。

由表2知聚合草葉蛋白中的各種必需氨基酸的含量與苜蓿[9]最接近，且必需氨基酸的含量的由高到低的順序一樣。葉片中必須氨基酸占總氨基酸的百分比高于自身根蛋白[10]、淮山藥以及棉籽蛋白。葉片的必需氨基酸含量低于馬鈴薯蛋白[11]。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比必需氨基酸含量（40.37%）低于雞蛋蛋白（49.7%）模式，但高于FAO/WHO模式的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（35.0%）。與雞蛋相比，差異主要表現(xiàn)在蛋氨酸+胱氨酸，蘇氨酸，賴氨酸的含量明顯要低，這也是植物蛋白與動(dòng)物蛋白的主要差別所在。

表2 聚合草葉蛋白與其他植物各種必需氨基酸含量比較（%）

3.3 必需氨基酸評(píng)分比較

按2.5.2方法對(duì)氨基酸進(jìn)行評(píng)分和必需氨基酸指數(shù)計(jì)算如下表3、表4。

表3 聚合草必需氨基酸評(píng)分比較

表4 聚合草必需氨基酸指數(shù)

由表3知，聚合草葉蛋白氨基酸評(píng)分高于苜蓿草蛋白（30%），與聚合草根（42.5%）、淮山藥蛋白（44.2%）接近，但低于棉籽蛋白和馬鈴薯蛋白。聚合草第一限制氨基酸為蛋氨酸，賴氨酸在聚合草中含量較高[11]。

從表4可以看出，聚合草葉蛋白 EAAI（1.2487）與同期苜蓿（1.2478）接近，為優(yōu)質(zhì)蛋白源，稍低于馬鈴薯、淮山藥和棉籽蛋白。

4 討論

4.1 蛋白提取率

酚法提取聚合草葉片總蛋白的得率最高（鮮葉84.7%、干葉62.51%），SDS法次之（鮮葉70.06%、干葉55.67%），TCA-丙酮沉淀法最差（鮮葉51.76%，干葉46.45%），且酚法所提蛋白質(zhì)較細(xì)膩，顏色較白，純度較高，鮮葉為64.40%，干葉為51.46%。

4.2 氨基酸評(píng)價(jià)

聚合草必需氨基酸組成為亮氫酸9.10%，纈氨酸6.14%，賴氨酸5.77%，苯丙氨酸5.34%，蘇氨酸4.97%，異亮氨酸4.17%，色氨酸1.48%，蛋氨酸1.11%，占氨基酸總量的38.08%。聚合草葉片氨基酸組成與苜蓿葉中氨基酸組成大體相同，高于自身根蛋白、淮山藥以及棉籽蛋白。高于FAO/WHO模式標(biāo)準(zhǔn)蛋白（35.0%），低于雞蛋蛋白（49.7%）模式。聚合草葉蛋白氨基酸評(píng)分高于苜蓿草蛋白，與聚合草根、淮山藥蛋白接近，但低于棉籽蛋白和馬鈴薯蛋白。綜上分析聚合草葉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在以上幾種物質(zhì)中僅次于馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，高于苜蓿草、和淮山藥與棉籽蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近。

5 結(jié)論

（1）對(duì)三種提取方法的蛋白提取率進(jìn)行比較，酚法優(yōu)于SDS法，SDS法又優(yōu)于TCA-丙酮沉淀法。酚法的提取率高達(dá)84.7%（鮮葉）或62.51%（干葉），蛋白提取物的純度為64.40%（鮮葉）或51.46%（干葉）?？蔀橐院蟠笠?guī)模聚合草葉蛋白提取并進(jìn)行生物學(xué)研究提供方法支持。

（2）聚合草氨基酸評(píng)分高，可作優(yōu)質(zhì)蛋白原，其氨基酸組成較平衡，氨基酸組成（40.37%）高于FAO/WHO模式標(biāo)準(zhǔn)蛋白（35.0%），低于雞蛋蛋白（49.7%）模式。

（3）聚合草葉蛋白質(zhì)中谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量較高，占總量的41.48%。

6 討論

實(shí)驗(yàn)采用了變性劑TCA等、還原劑DTT等、表面活性劑SDS等以及兩性電解質(zhì)等可以用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，并打開蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效溶解，從而顯著提高蛋白質(zhì)得率。