胡佳奇，許博文，程孟祺，趙雨薇，張 興，鄭紅剛，花寶金

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053）

肺癌（lung cancer）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計報告推算，2020 年將有大約1 930 萬癌癥新發(fā)病例及1 000 萬癌癥死亡病例，其中肺癌發(fā)病率和死亡率分別為11.4% 和18%，分別占據(jù)所有惡性腫瘤第二位和首位［1］。肺癌的發(fā)病與吸煙、環(huán)境接觸、遺傳等多種因素密切相關(guān)，手術(shù)、放療、化療等是肺癌目前主要的治療手段。據(jù)報道，約有80%的局限期小細(xì)胞肺癌患者和幾乎所有的廣泛期小細(xì)胞肺癌者在治療后1 年內(nèi)復(fù)發(fā)、進展或死亡［2］。1973～2010 年，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌的平均5 年生存率不超過20%，小細(xì)胞肺癌僅5.6%［3］。

肺癌于中醫(yī)又稱“肺積”，研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中醫(yī)藥不僅可以增強常規(guī)治療的作用，還能逆轉(zhuǎn)耐藥性、降低不良反應(yīng)和毒性、提高生活質(zhì)量［4］，具有很好的醫(yī)學(xué)發(fā)展前景。現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，正虛、癌毒、痰凝、瘀滯是肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵病理因素［5］，因而“清熱解毒”、“化痰散結(jié)”以及“活血化瘀”是中醫(yī)辨治肺癌的主要治法之一［6］。石見穿為唇形科鼠尾草屬植物紫參的全草，《中華本草》言其：“活血化淤、散結(jié)消腫”，基礎(chǔ)研究表明石見穿提取物能明顯抑制人肺癌細(xì)胞A549 增殖［7，8］；貓爪草則為毛茛種植物小毛茛的塊根或全草，《中華本草》言其：“解毒、化痰散結(jié)”，基礎(chǔ)研究表明貓爪草總苷能抑制A549 裸鼠移植瘤生長［9］。臨床上經(jīng)常將二者合用治療肺癌［10-12］，但此藥對作用于肺癌的具體機制尚無報道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)顧及中藥成分多樣、作用靶點豐富的特點，系統(tǒng)闡述中藥單品及復(fù)方的作用機制［13，14］，通過預(yù)測靶點有利于指導(dǎo)科研方向及開發(fā)新藥。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“石見穿-貓爪草”藥對治療肺癌的具體機制，為進一步的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石見穿和貓爪草的活性成分及靶點篩選

根據(jù)ADME 篩選原則，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 在TCMSP 平臺上對石見穿和貓爪草的全部成分進行篩選；通過查找文獻，收集已經(jīng)證實石見穿和貓爪草具有抗肺癌活性的有效化合物。在DrugBank 上將所有候選化合物尋找藥物靶點，并經(jīng)UniProt 校正為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。最后根據(jù)Pubchem Cid 查找化合物的2D 結(jié)構(gòu)，利用SwissTargetPrediction 進行靶點預(yù)測。將石見穿和貓爪草的預(yù)測靶點與藥物靶點分別去重匯總得到“石見穿-貓爪草”藥對靶點數(shù)據(jù)集。

1.2 肺癌相關(guān)靶點篩選

以“Lung Cancer”為 關(guān) 鍵 字，在GeneCards 和OMIM 檢索治療肺癌的潛在靶點。以“Lung Can‐cer”、“SCLC”、“NSCLC”為關(guān)鍵字，在DrugBank 查找治療肺癌靶點予以補充。在疾病靶點過多的情況下，以Relevance score≥15 為條件對GeneCards中獲得的疾病靶點進行篩選。將已獲得的疾病靶點進行匯總?cè)ブ?，建立疾病靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 藥物和疾病共同靶點的獲取

借助Venny（Version 2.1.0）獲得藥物和疾病的共同靶點，并繪制韋恩圖，可認(rèn)為是石見穿-貓爪草藥對治療肺癌的候選靶點。

1.4 “藥物‐化合物‐靶點‐疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點（node）代表藥物、成分、靶點和疾病，節(jié)點的大小以節(jié)點度值（Degree）表示，節(jié)點之間的關(guān)系以“邊”（edge）表示。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在STRING（Version 11.0）平臺上以物種為“Homo sapiens”、置信度為0.900 進行檢索得到PPI網(wǎng)絡(luò)。利用BioGrid、InWeb_IM、OmniPath 等數(shù)據(jù)庫進行PPI 的挖掘分析，應(yīng)用MCODE 進一步篩選核心的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點。

1.6 通路富集分析

GO 分析可以預(yù)測目標(biāo)基因在生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）上的聯(lián)系，而KEGG 則用于研究涉及的主要信號通路。GO 和KEGG 分析通過使用Metascape 完成?；贙EGG結(jié)果所映射的相關(guān)靶標(biāo)，以此構(gòu)建“通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)進一步篩選“貓爪草-石見穿”藥對治療肺癌的關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié)果

2.1 石見穿、貓爪草活性成分及靶點的獲取

共獲得2 個石見穿有效成分，12 個貓爪草有效成分。雖然部分化合物OB 和DL 值不符合要求，通過查看化合物“Related Disease”，納入包含“Lung Cancer”的石見穿有效成分10 個，貓爪草成分6 個。通過查閱文獻，補充具有抗肺癌功效的石見穿有效成 分“maslinic acid”［15，16］、“emodin”［17，18］、“salvianolic acid A”［19，20］和“kaempferol”［15，21］。最 終 獲 得 石 見 穿有效成分16 個、貓爪草有效成分18 個。

2.2 靶點的獲取

在DrugBank 中篩選活性成分的靶點，獲得石見穿活性成分對應(yīng)靶點321 個，貓爪草117 個；以Probability>0.8 在SwissTargetPrediction 對 所 有 活性成分進行靶點預(yù)測，得到石見穿預(yù)測靶點103 個，貓爪草1 個。將所有靶點匯總后去重，得到藥物靶點共276 個。在Genecards 和OMIM 分別得到1 675個、504 個肺癌靶點，在DrugBank 得到治療肺癌的西藥作用靶點293 個疾病靶點，共獲2 121 個疾病靶點。通過使用Venny2.1.0，獲得164 個藥物和疾病的共同靶點，經(jīng)靶點映射，獲得30 個有效化合物，其中石見穿和貓爪草共有的化合物為beta-sitosterol，見圖1、表1。

表1 潛在活性成分Tab 1 Potential active ingredients

圖1 靶點韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of target

2.3 “藥物‐化合物‐靶點‐疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)由197 個節(jié)點和521 條邊組成，如圖2。分析節(jié)點度值可知化合物排名前4 為quercetin、ursolic acid、beta-sitosterol、caffe‐ic acid，分別對應(yīng)134、43、32、20，這可能是石見穿-貓爪草藥對治療肺癌較為重要的活性成分。

圖2 “中藥‐化合物‐靶點‐疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig 2 "Traditional Chinese medicine compound target disease" network

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將164 個共同靶點上傳至STRING，剔除13 個游離靶點，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包含151 個靶點和727 條邊，見圖3。

圖3 靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI network of target

為了更精確地分析“石見穿-貓爪草”藥對治療肺癌的作用機制，通過MCODE 分析密集連接的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖4。根據(jù)Log10（P）值，分別保留PPI 網(wǎng)絡(luò)中3 個最佳評分的生物學(xué)過程并進行功能描述，見表2。

表2 PPI 內(nèi)部核心網(wǎng)絡(luò)模塊的功能描述（前3 位）Tab 2 Function description of PPI internal core network module（top 3）

圖4 PPI 內(nèi)部核心網(wǎng)絡(luò)模塊Fig 4 PPI internal core network module

2.5 富集分析

共有2 443 個GO 術(shù)語顯示富集，其中BP2 174個，CC84 個，MF185 個，KEGG 富 集 有170 條 信 號通路。據(jù)negLogP值排序，選擇前20 個用R 語言繪制GO 氣泡圖，選擇前20 個與肺癌相關(guān)的通路繪制KEGG 氣泡圖，見圖5。

從圖5 可知，涉及的主要GO 生物過程有cyto‐kines（細(xì)胞因子）、apoptosis（細(xì)胞凋亡）、oxidative stress（氧化應(yīng)激）、hormone stimulus（激素刺激）、plasma membrane transmission（質(zhì)膜傳遞）、protein kinase binding and activity（蛋白激酶的結(jié)合與活性）等。KEGG 結(jié)果包括pathways in cancer（癌癥途徑），non-small cell lung cancer（非小細(xì)胞肺癌），small cell lung cancer（小細(xì)胞肺癌），proteoglycans in cancer（癌癥中的蛋白聚糖），EGFR tyrosine ki‐nase inhibitor resistance（EGFR 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 劑耐藥），IL-17 signaling pathway（IL-17 信號通路），TNF signaling pathway（TNF 信號通路），PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號通路），Apoptosis（凋亡）等。

圖5 富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of enrichment analysis

為進一步揭示信號通路與候選靶標(biāo)及化合物之間的關(guān)系，構(gòu)建“通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖6。由圖可知，MAPK1、AKT1、PIK3R1、RAF1、EGFR 具有較大的Degree，為關(guān)鍵靶點。

圖6 “通路‐靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig 6 "Pathway‐target" network

3 討論

中藥搭配使用具有協(xié)同促進作用，但組分更加復(fù)雜，對應(yīng)的靶點也眾多，難以闡明具體的作用機制。本研究通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行分析，預(yù)測“石見穿-貓爪草”藥對治療肺癌的有效成分、關(guān)鍵靶點及信號通路，探討其分子作用機制。

3.1 潛在有效成分

本研究預(yù)測“石見穿-貓爪草”藥對為作用于肺癌的主要成分包括quercetin（槲皮素）、ursolic acid（熊果酸）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和caffeic acid（咖啡酸）。

現(xiàn)有實驗證實槲皮素能通過STAT3、AMPK/mTOR 通路促進肺癌細(xì)胞的凋亡、自噬進而抑制增殖和侵襲［22-25］，王靜等［26］進一步發(fā)現(xiàn)其與吉非替尼聯(lián)用時可能通過促進細(xì)胞凋亡起到協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞增殖的效果。王玉波等［27］則發(fā)現(xiàn)槲皮素逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞耐藥的機制可能與下調(diào)P-糖蛋白和sur‐vivin 蛋白有關(guān)。熊果酸主要通過調(diào)控miRNA 抑制人A549 細(xì) 胞 增 殖、遷 移、侵 襲［28，29］并 促 進 其 凋亡［30，31］以達到抑瘤的效果。G2/M 期是決定細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵時期。周玲玉等［32］發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過引起肺癌細(xì)胞在該時期出現(xiàn)阻滯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wang 等［33］的 研 究 結(jié) 果 表 明β-谷 甾 醇 具 有 治 療NSCLC 的潛力。目前并無研究表明咖啡酸具有抗癌效果，其主要用于預(yù)防肺癌患者放、化療后出現(xiàn)的白細(xì)胞減少［34，35］。

3.2 關(guān)鍵基因靶點

本研究預(yù)測MAPK1、AKT1、PIK3R1、RAF1、EGFR 是“石見穿-貓爪草”藥對干預(yù)肺癌的潛在基因靶標(biāo)。

MAPK1/ERK2 是MAPK/ERK 信 號 通 路 重 要的蛋白激酶。多項研究表明肺癌細(xì)胞中MAPK/ERK 通路過度激活將促進腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及增加耐藥性［36-38］。陳婷等［39］研究發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉水提物含藥血清即可通過下調(diào)MAPK1/ERK2 表達以增強吉非替尼對人肺癌A549 細(xì)胞增殖的抑制作用。許海平等［40］的臨床研究同樣表明尼妥珠單抗提高非小細(xì)胞肺癌患者近期療效的機制與下調(diào)MAPK1/ERK2 表達有關(guān)。陳偉莊等［41］則發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿MAPK1/ERK2 含量明顯高于對照組，對肺癌的診斷有一定參考意義。

AKT1 參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移［42］，與肺癌 的 發(fā) 生 密 切 相 關(guān)［43］。Pan 等［44］的 研 究 表 明 上 調(diào)AKT1 表達可促進肺腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡。王 嘉 等［45］發(fā) 現(xiàn)65 例NSCLC 患 者 癌 組 織 中AKT1 的表達明顯升高，楊艷榮等［46］進一步觀察90例NSCLC 患者的遠(yuǎn)期生存，發(fā)現(xiàn)癌組織AKT1 蛋白表達陽性患者的3 年生存率顯著低于表達陰性的患者，提示AKT1 蛋白過表達可能是腫瘤進展及不良 預(yù) 后 的 危 險 因 素。有 研 究［47，48］表 明AKT1 和AKT2 在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起反向調(diào)控，下調(diào)AKT1 抑制肺癌生長，而下調(diào)AKT2 則促進肺癌生長，因而在選擇性靶向抑制AKT1 可能比同時抑制AKT 三種亞型的更有效，Chorner 等［49］的研究結(jié)果支持此觀點。

PIK3R1 編碼的蛋白p85 為PI3K 的調(diào)節(jié)亞單位。p85 促使PI3K 活化進而激活PI3K/AKT 通路促進腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進腫瘤血管生成、調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期和促進腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移［50］。Tian 等［51］的研究表明miR-486-5p 可直接調(diào)控PIK3R1 抑制細(xì)胞增殖、侵襲和誘導(dǎo)凋亡。孫站兵等［52］通過分析數(shù)據(jù)庫中肺纖維化miRNA 和肺癌mRNA 芯片資料，認(rèn)為PIK3R1 是肺癌的潛在治療靶點。

RAF1 是RAS-RAF-MAPK/ERK 信 號 通 路 重要的上游啟動因素。Qiu 等［53］發(fā)現(xiàn)下調(diào)RAF1 可減少非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，促進凋亡和停滯分裂周期。Tian 等［54］的研究進一步提示RAF1 的下調(diào)可能是 由miR-135 作 用 于RAB1B 實 現(xiàn)。Tian［55］和 蔡琴［56］的 研 究 團 隊 發(fā) 現(xiàn)RAF1 高 表 達 或RAF 激 酶 抑制蛋白的下調(diào)是NSCLC 患者進展時間的獨立危險因素，RAF1 可能是改善NSCLC 患者預(yù)后潛在治療靶點［57］。

EGFR 突 變 可 引 起PI3K-AKT、RAS-RAFMAPK/ERK 等信號通路激活，促進腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及抑制凋亡［58］。EGFR 主要有3 種突變類型，許廣輝等［59］的研究發(fā)現(xiàn)相對于外顯子20 T790M 突 變 和 外 顯 子21 L858R 突 變，EGFR 外 顯子19 突變的NSCLC 患者有更好的無瘤生存時間，且EGFR 突變類型的差異可能與術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移部位相關(guān)。

3.3 GO 和KEGG 分 析

GO 分析結(jié)果表明“石見穿-貓爪草”藥對通過調(diào)控細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、質(zhì)膜傳遞、蛋白激酶的結(jié)合與活性、細(xì)胞凋亡等過程來發(fā)揮抗肺癌的作用。

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞合成的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、免疫應(yīng)答、促進細(xì)胞凋亡和參與炎癥反應(yīng)等豐富生物學(xué)功能的小分子多肽或糖蛋白，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分［60］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［61］。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)對于維持胞內(nèi)信號的正確傳遞至關(guān)重要［62］，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而引起癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和進展［63］。Nrf2是氧化應(yīng)激過程的關(guān)鍵開關(guān)［64］，在腫瘤組織中Nrf2表達水平明顯升高的癌癥患者，其生存率較低［65］，是判斷癌癥預(yù)后的重要分子標(biāo)記物。質(zhì)膜傳遞、蛋白激酶的結(jié)合與活性為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵生物過程，直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。

KEGG 結(jié)果顯示“石見穿-貓爪草”藥對可以直接調(diào)控癌癥途徑、非小細(xì)胞肺癌途徑和小細(xì)胞肺癌途徑；還包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、IL-17、TNF、PI3K-Akt 和凋亡，這與本研究預(yù)測靶點的功能基本一致，也證實了本研究的真實性與網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的高度關(guān)聯(lián)性。

4 結(jié)語

本研究推測“石見穿-貓爪草”藥對治療肺癌的有效成分為槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇、咖啡酸等，通過作用于MAPK1、AKT1、PIK3R1、RAF1、EGFR等靶點以調(diào)控細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、質(zhì)膜傳遞、蛋白激酶的結(jié)合與活性、細(xì)胞凋亡等過程，主要涉及癌癥、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌途徑以及IL-17、TNF、PI3K-AKT 和凋亡等信號通路。經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的挖掘，本研究能為臨床上“石見穿-貓爪草”藥對用于肺癌的合理應(yīng)用提供科學(xué)證據(jù)，也為進一步的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

作者貢獻度說明：

胡佳奇、許博文：對藥物和疾病靶點進行了篩選，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，最后撰寫整篇文章；程孟祺：進行了富集分析；趙雨薇、張興：對結(jié)果進行了討論；鄭紅剛、花寶金：為本文的撰寫思路提供指導(dǎo)，并給予資金支持。