李秋娥，秦 余，鄭喬木，譚國(guó)棟，廖 海，周嘉裕

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

植物中所有含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由苯丙烷類合成途徑直接或間接所產(chǎn)生的，該途徑是植物中最重要的次生代謝途徑之一，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆防御反應(yīng)等生理過程息息相關(guān)[1]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)將苯丙氨酸非氧化脫氨轉(zhuǎn)化生成反式肉桂酸，然后形成香豆素與綠原酸等中間體，最后轉(zhuǎn)化為異黃酮、木質(zhì)素與生物堿等次生代謝產(chǎn)物[2]。歐芹PAL結(jié)構(gòu)中的Ala-Ser-Gly形成了4-methylidene-imidazole-5-one(MIO)環(huán)化結(jié)構(gòu)，與酶的催化反應(yīng)相關(guān)，為解析PAL的催化機(jī)制與合理化改造奠定了基礎(chǔ)[3]。

PAL是苯丙烷合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其表達(dá)強(qiáng)弱與植物抗逆性強(qiáng)弱呈正相關(guān)，這也使其成為苯丙烷途徑代謝調(diào)控的重要候選基因之一[4-5]。目前，已從單細(xì)胞藻類[6]、裸子[7]與被子植物[8]等不同類別植物中克隆獲得PAL基因。過表達(dá)PAL基因的轉(zhuǎn)基因植物獲得了較高的生長(zhǎng)發(fā)育速度與較強(qiáng)的抗逆性，而降低PAL基因的表達(dá)導(dǎo)致植物木質(zhì)素合成減少和抗逆性減弱[2, 9]。提高PAL基因的表達(dá)效率是開展以PAL基因?yàn)榘悬c(diǎn)代謝調(diào)控的重要基礎(chǔ)。然而，由于物種密碼子的不同，其各自特有的偏好性也有所差別，因此必須分析外源基因密碼子偏好性，選擇適宜宿主來表達(dá)外源基因，通過對(duì)密碼子進(jìn)行合理優(yōu)化進(jìn)而提高外源基因的表達(dá)效率[10]。此外，通過對(duì)密碼子偏好性的分析，還能夠了解密碼子偏好性形成的機(jī)制及不同物種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系[11]。

本文從NCBI下載41條不同植物來源的PAL基因序列，及本課題組獲得的暗紫貝母轉(zhuǎn)錄組中的PAL基因序列，利用CodonW、EMBOSS、SPSS、Origin與MEGA等程序與在線軟件獲得密碼子偏好性、RSCU聚類樹及系統(tǒng)進(jìn)化樹等信息。通過比較擬南芥、煙草、大腸桿菌和酵母等模式生物體的密碼子，確定最適表達(dá)宿主。以上結(jié)果將為開展PAL基因的功能鑒定、植物遺傳進(jìn)化研究及轉(zhuǎn)基因植物培育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)來源

暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)轉(zhuǎn)錄組經(jīng)過功能注釋后，獲得暗紫貝母PAL(FuPAL)基因的CDS序列。其余41種不同植物的PAL基因序列來源于GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，登錄序號(hào)見表1。從密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中獲得了模型生物如酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)。

表1 PAL的密碼子偏好性參數(shù)

1.2 PAL基因的密碼子偏好性分析

采用EMBOSS在線程序(http://emboss.toulouse.inra.fr.)以及CodonW程序分析PAL基因的編碼序列(coding sequence，CDS)的RSCU、有效密碼子數(shù)(effective number of codon，ENc)、密碼子G/C含量、密碼子第3位G/C含量GC3s、密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)等，并用SPSS分析相關(guān)基因及基因組密碼子使用偏好性聚類。用PAL基因的ENc及GC3s值構(gòu)建散點(diǎn)圖和ENc-GC3s期望曲線：ENc=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]。

利用MEGA-X軟件鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建PAL的系統(tǒng)進(jìn)化樹，檢驗(yàn)方法設(shè)為Bootstrpmethod，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)為1 000，分析其在進(jìn)化上的親緣關(guān)系。通過聚類樹的比較，分析PAL密碼子偏好性與物種進(jìn)化之間的聯(lián)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL同義密碼子相對(duì)使用度

RSCU反映的是特定密碼子編碼其對(duì)應(yīng)氨基酸時(shí)同義密碼子之間的相對(duì)使用概率，當(dāng)RSCU>1，說明該密碼子的相對(duì)使用頻率較高；當(dāng)RSCU<1，則說明相對(duì)使用頻率較低[12]。圖1為根據(jù)42條PAL的RSCU值制作的熱圖，結(jié)果顯示密碼子相對(duì)使用度在單子葉植物、雙子葉植物和其他低等植物PAL之間存在較大差異，并且單子葉與其他植物差異存在顯著分界線。單子葉、雙子葉及其他低等植物PAL的優(yōu)勢(shì)密碼子(RSCU>1)分別有22、18與10個(gè)，且最優(yōu)密碼子分別為CUC、UUG與CUG。由于單子葉植物有ACC、CUC、AUC和GGC等4種優(yōu)勢(shì)密碼子的RSCU>2，而其他種類植物優(yōu)勢(shì)密碼子的RSCU均小于2，說明單子葉植物的密碼子偏好性強(qiáng)于其他植物[13]。

圖1 PAL的RSCU熱圖

2.2 PAL偏好性相關(guān)參數(shù)比較

圖2為42條PAL的GC、GC3s、CAI與Enc熱圖，顯示不同植物類群的密碼子偏好性參數(shù)可以被有效聚類。單子葉、雙子葉和其他低等植物PAL的GC平均值分別是58.9%、46.6%和53.2%，GC3s平均值分別為75.4%、45%和59%。結(jié)果表明雙子葉植物PAL偏好AT，而單子葉和其他植物PAL偏好CG。單子葉、雙子葉和低等植物ENc平均值分別為42、51.8、50.4。這說明單子葉植物的PAL基因相比其他植物的PAL基因的密碼子偏好性更強(qiáng)。

圖2 PAL的密碼子偏好性參數(shù)

2.3 PAL系統(tǒng)進(jìn)化樹及RSCU聚類

根據(jù)42條PAL基因的CDS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)能夠有效反映PAL基因在進(jìn)化上的親緣關(guān)系(圖3)。42條PAL基因被分為兩大簇類，第1簇由被子植物組成(葡萄、紫萍例外)，第2簇由其他植物組成。第1簇中，單雙子葉植物又分別聚類為兩個(gè)小簇。第2簇中，大多數(shù)蕨類與苔蘚植物小立碗蘚聚集。在RSCU聚類(圖4)中PAL基因也可大致分為2大簇。第1簇包含了大多數(shù)雙子葉及少量蕨類、裸子植物；第2簇主要由單子葉、蕨類與苔蘚植物組成，然而單子葉植物玉米和雙子葉植物莧卻單獨(dú)形成兩個(gè)分支。苔蘚植物小立碗蘚與蕨類問荊靠近，與蕨類退化形成苔蘚類植物的觀點(diǎn)相符。將RSCU聚類與系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行比較，表明RSCU聚類反映植物進(jìn)化的關(guān)系準(zhǔn)確度弱于系統(tǒng)進(jìn)化樹。類似現(xiàn)象已多次發(fā)現(xiàn)，其原因可能源于基因的倍增和重組、水平的基因轉(zhuǎn)移等[14]。

圖3 PAL系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 PAL的RSCU值聚類分析

2.4 ENC-polt圖分析

以GC3s為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)繪制ENc-plot圖，自然選擇或是堿基突變的影響導(dǎo)致密碼子偏好性可以由圖中各點(diǎn)離期望曲線顯示，距期望值近則受堿基突變影響較大，反之受自然選擇影響大[15]。ENc-plot圖(圖5)顯示來源于單子葉植物的暗紫貝母、雜交百合、石蒜、紫萍與鳳梨PAL基因，以及來源于雙子葉植物的擬南芥PAL基因分布于期望曲線附近，表明突變影響是導(dǎo)致這6種PAL基因密碼子偏好性形成的主要因素，而自然選擇影響是導(dǎo)致其余植物密碼子偏好性形成的主要因素。

圖5 PAL基因的ENc-plot分析

2.5 PAL與模式生物密碼子偏好性對(duì)比

將42種PAL密碼子使用頻率與大腸桿菌、酵母、煙草與擬南芥等常用表達(dá)宿主的基因組密碼子使用頻率進(jìn)行比較，計(jì)算密碼子適應(yīng)指數(shù)，值越大，則說明外源基因在宿主內(nèi)的表達(dá)水平越高。結(jié)果顯示，相比煙草，擬南芥更適合作為42種植物PAL的遺傳轉(zhuǎn)化宿主。暗紫貝母、百合、郁金香、異葉天南星、鳳梨、玉米、水稻、西谷椰子、香蕉與紫萍等10種單子葉植物和問荊、江南卷柏和小立碗蘚等低等植物，大腸桿菌是比酵母更適合的外源表達(dá)宿主，而酵母是適合其余植物的外源表達(dá)宿主。

3 討論與結(jié)論

單雙子葉、低等植物等不同植物來源PAL基因有不同的優(yōu)勢(shì)密碼子，提示余下的非優(yōu)勢(shì)密碼子可能是密碼改造的重點(diǎn)區(qū)域。裴建軍[16]利用類似思路，對(duì)海棲熱袍菌木聚糖酶基因的非優(yōu)勢(shì)密碼區(qū)域進(jìn)行改造，提高了表達(dá)效率。Enc值是目前評(píng)價(jià)密碼子偏好性強(qiáng)弱最具參考價(jià)值的參數(shù)，Enc分析發(fā)現(xiàn)植物PAL偏好性整體性較弱，這可能導(dǎo)致植物PAL基因的表達(dá)較弱，使其成為苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵步驟。Huang等[9]也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即植物苯丙烷類化合物與PAL基因的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)性。分析同樣來自苯丙烷代謝途徑的COMT、4CL[17]等對(duì)G/C偏好性，發(fā)現(xiàn)它們具有相同的G/C偏好性，并且來自單子葉植物與低等植物PAL偏好G/C，雙子葉植物PAL偏好A/T，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是單、雙子葉植物在進(jìn)化過程和生存環(huán)境的差異[18]。同時(shí)，推測(cè)來源于同一代謝途徑的基因可能受到相近的遺傳壓力，從而表現(xiàn)出相近的密碼子偏好性。

ENc-plot分析(圖5)顯示，雙子葉植物(除擬南芥)與低等植物的PAL基因偏好性主要受自然選擇的影響，單子葉植物既受到突變影響又受到自然選擇影響。這一結(jié)果與張孟偉等[19]的觀點(diǎn)一致，他們認(rèn)為自然選擇壓力導(dǎo)致了苯丙氨酸解氨酸密碼子使用偏好性的產(chǎn)生。嚴(yán)子成等[14]發(fā)現(xiàn)COMT基因的密碼子偏好性形成主要受自然選擇影響。對(duì)比基于密碼子偏好性的RSCU聚類與基于核酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹證實(shí)，RSCU聚類在一定程度上能夠反映物種進(jìn)化的關(guān)系，但和系統(tǒng)進(jìn)化樹相比其準(zhǔn)確度較弱，推測(cè)其原因，可能是PAL核酸序列更易受到自然選擇的影響，而單子葉植物PAL密碼子偏好性受自然選擇與突變的雙重影響。侯惠靜等[20]與嚴(yán)子成等[14]也認(rèn)為基于密碼子偏好性的聚類與物種的真實(shí)系統(tǒng)關(guān)系存在少量差異，提示物種分類不僅限于對(duì)核苷酸序列分析，也需要結(jié)合不同水平上的綜合結(jié)果才能獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。

通過與模式生物對(duì)比，可為不同植物PAL選擇適合的外源表達(dá)載體提供參考。例如，大腸桿菌相比酵母更適合作單子葉植物PAL的外源表達(dá)載體，已有單子葉植物玉米PAL在大腸桿菌中獲得了成功表達(dá)，其重組蛋白可同時(shí)催化苯丙氨酸和酪氨酸[21]。相比煙草，擬南芥更適合作為所有植物PAL的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，提示以擬南芥基因組密碼子為參考，對(duì)PAL基因進(jìn)行改造，能夠獲得高效表達(dá)，用于植物抗逆育種及PAL基因的功能研究。

通過分析42種PAL基因的密碼子偏好性，發(fā)現(xiàn)各序列的優(yōu)勢(shì)密碼子，可通過對(duì)該基因非優(yōu)勢(shì)密碼區(qū)域進(jìn)行改造從而提高表達(dá)效率，為提高植物基因的表達(dá)提供理論指導(dǎo)。通過對(duì)比模式生物的密碼子偏好性，確定不同植物PAL基因最適表達(dá)宿主，大腸桿菌適合絕大多數(shù)單子葉植物表達(dá)，酵母適合雙子葉等植物；擬南芥相比煙草更適合作為所有42種植物PAL基因的遺傳轉(zhuǎn)化宿主，可為PAL的異源表達(dá)提供理論依據(jù)。研究結(jié)果可為開展植物PAL基因的功能鑒定、植物遺傳進(jìn)化研究與轉(zhuǎn)基因植物培育等奠定理論基礎(chǔ)。