嚴栩蘅，廖栩崢，何建國，尹 斌，李朝政

(1.中山大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，珠海 519082; 2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(珠海)，珠海 519082；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525099)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，是我國及全球重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種之一[1]。病害是制約我國對蝦業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸，其中以病毒性疾病危害最嚴重。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)和十足類虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1，DIV1)是引起對蝦病毒性病害的病毒。WSSV主要感染起源于外胚層和中胚層的組織細胞，造成不同組織廣泛的變性壞死[2]，其中以鰓、胃、頭胸甲和附肢的表皮細胞最敏感。病蝦患病初期常靜臥水底，甲殼上有白斑，出現(xiàn)空腸；患病后期體色泛紅，對外界反應(yīng)遲鈍，死亡率極高，發(fā)病后3～14 d內(nèi)死亡率可達100%[3-8]。DIV1是近年來在我國新發(fā)現(xiàn)的一種DNA病毒，主要感染鰓、肝胰臟、周足以及肌肉的造血組織和血細胞，有報道稱其還會感染來自外胚層的表皮和淋巴器官[9]。病蝦通常表現(xiàn)出空腸，肝胰腺萎縮，體色變淺，軟殼等癥狀，患病后期喪失游泳能力[9-11]。此外，DIV1感染的凡納濱對蝦有時會出現(xiàn)游泳足附近的甲殼發(fā)黑的癥狀[12]。

凝血系統(tǒng)是生物先天免疫的重要組成部分，通過形成穩(wěn)定的凝塊封閉傷口防止體液流失[13-14]，也可以與其它免疫反應(yīng)協(xié)同參與宿主免疫[15-16]。凡納濱對蝦受到外來病原侵染時，鈣依賴性谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(transglutaminase，TG)從血細胞中釋放，與血淋巴中的凝固蛋白(clotting protein，CP)形成交聯(lián)聚集體，避免外界微生物從傷口侵入[17-18]。目前在凡納濱對蝦中已鑒定出兩種TG，分別為I型(LvTGI)和II型(LvTGII)[19-21]。

甲殼類TG除參與凝血功能外，還在參與宿主免疫中發(fā)揮著重要作用。已有研究顯示，TG在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)和凡納濱對蝦中參與了抗副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[22]和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[23]等細菌的免疫反應(yīng)。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，通過qPCR和RNA干擾等方法，探究對蝦LvTGI、LvTGII等凝血系統(tǒng)相關(guān)基因在抗病毒免疫反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦養(yǎng)殖于嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名基地，對蝦規(guī)格為每尾5 g左右，實驗前在鹽度為2.5%的人工海水中暫養(yǎng)7 d以減少環(huán)境應(yīng)激，每天投喂商品化的對蝦飼料3次，每天換水1次。

1.2 方法

1.2.1 WSSV和DIV1人工感染

取WSSV 或DIV1感染后的病蝦肌肉組織1 g置于勻漿器中，加入10 mL無菌PBS，勻漿后使用0.22 μm濾膜進行過濾，濾液即為病毒原液。根據(jù)絕對定量測定病毒濃度，使用無菌PBS稀釋濃度后用于人工感染實驗。經(jīng)測定WSSV的感染濃度為3.62×103copies/μL，DIV1感染濃度為2.88×102copies/μL，實驗中每尾蝦注射50 μL病毒稀釋液。

將實驗用蝦分為2個實驗組和1個對照組，每組各90尾對蝦，在養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)72 h后，轉(zhuǎn)移至玻璃箱中進行WSSV和DIV1人工感染實驗。采用肌肉注射感染方法，使用1 mL胰島素注射器將稀釋后的WSSV和DIV1 病毒液注入凡納濱對蝦第二腹肢肌肉內(nèi)，對照組注入無菌PBS，每尾蝦注射50 μL。注射感染病毒后每隔12 h采集對蝦鰓和肝胰腺組織存放于RNAlater中，于-80°C保存，用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.2 凝血現(xiàn)象觀察

凡納濱對蝦感染病毒后，使用2 mL注射器每隔12 h采集1 mL對蝦血淋巴(不添加ACD抗凝劑)，置于2 mL離心管中，于4 °C保存，用于拍照觀察。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成

將保存于RNA later中的凡納濱對蝦各組織提取總RNA，所用相關(guān)器皿及試劑提前做相應(yīng)處理去除RNase污染。稱取0.5 g對蝦鰓組織或肝胰腺組織放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，使用RNeasy Mine 試劑盒(Qiagen，Germany)提取總RNA，提取方法如說明書所示。提取RNA經(jīng)過Bioanalyzer 2100進行濃度與純度測定，之后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA。

1.2.4 定量PCR(qPCR)

根據(jù)LvCP、LvTGI和LvTGII的mRNA序列設(shè)計針對上述基因的特異性qPCR引物，以EF-1α作為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)體系：5 μL SYBR Mix，0.2 μL正向/反向特異性引物，3.6 μL RNase-free H2O，總體系為10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，40個循環(huán)；95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)1 min以獲得熔解曲線；最后設(shè)定50 ℃降溫30 s。每份樣品進行3次重復(fù)，用Livak法(2-ΔΔCt)對結(jié)果進行分析計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

1.2.5 dsRNA合成

重新設(shè)計PCR引物擴增LvTGI和LvTGII后回收片段連接至pMD-19T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，重組質(zhì)粒送至公司進行測序，確認序列來自LvTGI和LvTGII后作為dsRNA第一鏈合成模板。設(shè)計含有T7序列的特異性引物，按照T7 RiboMAX Express RNAi System(promega)試劑盒說明書合成dsRNA。dsRNA引物序列同表1。

表1 本文所用引物信息

1.2.6 RNA干擾(RNAi)及死亡率統(tǒng)計

將實驗用蝦分為2個實驗組和1個對照組，每組各100尾。前期在養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)72 h后，轉(zhuǎn)移至玻璃箱中進行實驗。每尾蝦注射10 μg dsRNA用于干擾目的基因的表達。dsRNA注射后48 h，采集鰓組織用于提取總RNA。采用qPCR方法對LvTGI和LvTGII的表達量進行分析，驗證RNAi的干擾效率。注射dsRNA 48 h后，采用同1.2.1的方法進行WSSV和DIV1人工感染。每隔4 h進行一次觀察計數(shù)，統(tǒng)計7 d內(nèi)的累積死亡率。檢測樣品制備方法見1.2.3，檢測干擾效率的qPCR引物同表1。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 WSSV和DIV1感染影響血淋巴凝固

感染病毒后，每隔12 h抽取對蝦血淋巴，觀察血淋巴的凝固情況。正常情況下，對蝦血淋巴從體內(nèi)抽出后，幾分鐘內(nèi)就會從液體狀轉(zhuǎn)變成不可流動的膠體狀。在WSSV及DIV1感染后12、24 h血淋巴均能凝固[圖1(a)和(b)]，在WSSV及DIV1感染60 h后，對蝦血淋巴不再凝固，保持可流動的液體狀態(tài)[圖1(e)和(f)]。DIV1對血淋巴凝固的影響強于WSSV，在感染36 h后血淋巴不再呈膠體狀[圖1(c)(d)(e)和(f)]，而WSSV在感染60 h后才出現(xiàn)不凝固的現(xiàn)象[圖1(e)和(f)]。結(jié)果表明，兩種病毒感染均會影響凡納濱對蝦血淋巴凝固。

(a)～(f)分別為感染W(wǎng)SSV和DIV1在12 h(a)、24 h(b)、36 h(c)、48 h(d)、60 h(e)和72 h(f)時觀察血淋巴凝固的情況，最左側(cè)為注射PBS的對照組。

2.2 凝血相關(guān)基因響應(yīng)WSSV和DIV1表達

人工感染W(wǎng)SSV和DIV1后，采用qPCR方法檢測凡納濱對蝦凝血系統(tǒng)相關(guān)基因LvCP、LvTGI和LvTGII分別在鰓組織和肝胰腺中的表達量。結(jié)果顯示：在鰓組織中，LvCP與LvTGI的表達整體受到抑制。LvCP在WSSV感染12 h到60 h內(nèi)的表達量顯著下調(diào)[圖2(a)]。LvTGI在兩種病毒感染24 h后的表達量都顯著下降[圖2(b)]。LvTGII在WSSV感染后的表達量顯著上調(diào)，在72 h時表達量最高，是對照組的17倍，而在DIV1感染24 h到48 h內(nèi)顯著下調(diào)[圖2(c)]。在肝胰腺中，LvCP在WSSV感染后表達量顯著上調(diào)，在DIV1感染后的表達趨勢先上升后下降[圖2(d)]。LvTGI在兩種病毒感染24 h后的表達量均顯著下調(diào)[圖2(e)]。值得注意的是，LvTGII在肝胰腺中的表達情況與在鰓組織中相反，在WSSV感染12 h到48 h內(nèi)的表達趨勢下降，而在DIV1感染后表達量顯著上調(diào)[圖2(f)]。結(jié)果證實病毒感染會影響凡納濱對蝦凝血系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，推測凡納濱對蝦TG是病毒與凝血系統(tǒng)相互作用的靶點。

(a)～(c)分別為LvCP、LvTGI、LvTGII在鰓組織中的表達情況；(d)～(f)分別為LvCP、LvTGI、LvTGII在肝胰腺中的表達情況。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

2.3 敲降凝血相關(guān)基因抑制血淋巴凝固且增加對蝦對WSSV或DIV1的易感性

為了進一步探究凡納濱對蝦凝血相關(guān)基因TG是否參與抗病毒免疫反應(yīng)，采用RNAi方法敲降LvTGI和LvTGII，48 h后人工注射WSSV或DIV1，統(tǒng)計累積死亡率情況。qPCR結(jié)果顯示，RNA干擾后LvTGI和LvTGII的表達量都顯著低于對照組，表明dsRNA能夠有效地敲降LvTGI和LvTGII基因[圖3(a)]。敲降LvTGI和LvTGII后的蝦血呈明顯的流動液體狀[圖3(b)]，進一步證實了LvTGI和LvTGII為凝血系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因。對病毒感染后的累積死亡率進行統(tǒng)計分析，敲降LvTGI和LvTGII后的患病對蝦累積死亡率顯著高于其對照組，且敲降LvTGII比敲降LvTGI對病毒感染后死亡情況的影響程度更大[圖3(c)(d)和(e)]。結(jié)果表明，敲降凝血相關(guān)基因(LvTGI和LvTGII)干擾了血淋巴凝固及增加了對蝦對WSSV和DIV1的易感性。

(a)～(e)分別為注射dsRNA后，鰓組織中RNAi干擾效率檢測(a)、敲降LvTGI和LvTGII 48 h后的凝血現(xiàn)象觀察(b)、單獨敲降LvTGI和LvTGII后對蝦死亡情況(c)、敲降LvTGI和LvTGII后感染W(wǎng)SSV對蝦累積死亡率(d)、敲降LvTGI和LvTGII后感染DIV1對蝦累積死亡率(e)；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

3 討論與結(jié)論

大部分無脊椎動物擁有開放式循環(huán)系統(tǒng)，血淋巴通過開放式循環(huán)系統(tǒng)在各個組織間流動，其在運輸氧氣、傳遞信號、修復(fù)損傷、抵御病原入侵等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。血淋巴凝結(jié)通常指無脊椎動物中由多種蛋白參與的一類復(fù)雜生物學(xué)過程，其生物學(xué)效應(yīng)為使得流動的血淋巴變成不能流動的膠凍狀凝塊。因為是開放式循環(huán)系統(tǒng)，無脊椎動物相比脊椎動物更加依賴血淋巴來維持體液穩(wěn)態(tài)和抵御由體表創(chuàng)傷引起的病原入侵。本研究主要探討了兩種水產(chǎn)DNA病毒(WSSV和DIV1)感染對宿主(對蝦)血淋巴凝結(jié)的影響，以及對蝦凝血相關(guān)基因在抵御病毒感染過程中的作用。

3.1 WSSV和DIV1感染對蝦抑制血淋巴凝結(jié)

對蝦血淋巴可能是多種不同病原感染后的共同作用位點。我們發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV或DIV1后都會出現(xiàn)血淋巴凝固被抑制或不凝固的現(xiàn)象。已有研究報道，凡納濱對蝦感染桃拉綜合征病毒(taura syndrome virus, TSV)后也會出現(xiàn)血淋巴凝固不良的現(xiàn)象[24]，哈維弧菌(Vibrioharveyi)感染或其細胞外產(chǎn)物同時會導(dǎo)致血淋巴不凝結(jié)的現(xiàn)象[25]。這些報道表明，血淋巴是凡納濱對蝦免疫反應(yīng)的部位之一，在不同病原感染過程中可能發(fā)揮重要的作用，病原感染會不同程度地破壞或抑制血淋巴正常凝集功能。

3.2 凝血相關(guān)基因LvTGI、LvTGII及CP不同程度地響應(yīng)兩種病毒感染

病毒感染會導(dǎo)致血淋巴凝固異常，表明凝血相關(guān)基因的表達可能會受到病毒感染的影響，凝血系統(tǒng)與抗病毒免疫之間存在關(guān)聯(lián)性。在WSSV和DIV1感染下，LvCP在鰓組織中的表達量被明顯抑制，而在肝胰腺中的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象。Yeh等[26]發(fā)現(xiàn)在斑節(jié)對蝦CP在鰓組織中表達量較高，而在肝胰腺中表達量較低。綜上結(jié)果推測，在病毒感染后不同組織的CP響應(yīng)感染的程度不同。然而，當(dāng)前我們?nèi)圆恢肋@種上調(diào)是否是主動應(yīng)對感染以維持血淋巴的正常功能，以及下調(diào)是否是由病毒感染出現(xiàn)的被動行為(抑制表達)。LvTGI在兩種病毒感染后，在鰓組織和肝胰腺組織均被顯著抑制，因此，LvTGI可能是探究宿主基因響應(yīng)這兩種病毒感染是否是被動行為的重要候選基因。LvTGII在受到病毒刺激后，在不同部位均有表達量上調(diào)的情況出現(xiàn)，然而，LvTGII在面對不同病毒感染時的表達模式存在差異：WSSV刺激后，LvTGII在鰓組織中表達量顯著上調(diào)，而在肝胰腺中的表達量則先下降，后上升；DIV1刺激后，LvTGII在鰓組織的表達中受到抑制，而在肝胰腺中則顯著上調(diào)表達。已有研究顯示，WSSV主要感染鰓組織與上皮細胞[27]，DIV1主要感染對蝦血細胞與肝胰腺等[28]，推測病毒感染后LvTGII表達量變化可能與病毒侵染部位有關(guān)，具體機制有待深入研究。

3.3 LvTGI和LvTGII在血淋巴凝結(jié)以及宿主防御病毒侵染中發(fā)揮重要作用

LvTGI和LvTGII是凡納濱對蝦TG的兩種亞型，為了驗證TG的免疫作用，使用RNAi敲降LvTGI和LvTGII，并統(tǒng)計敲降后對蝦感染病毒后的死亡率情況。抑制LvTGI和LvTGII表達均會出現(xiàn)血淋巴明顯不凝固的現(xiàn)象，表明凡納濱對蝦LvTGI和LvTGII都是凝血系統(tǒng)的關(guān)鍵基因。在感染兩種病毒后，敲降LvTGI和LvTGII的對蝦都出現(xiàn)了累積死亡率上升的情況，且敲降LvTGII對死亡率的影響比敲降LvTGI更明顯。已有報道表明TG在抗病免疫中起到了積極作用：Maningas等[29]發(fā)現(xiàn)在日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)中敲降TG會加速感染W(wǎng)SSV對蝦的死亡。而Fagutao等[30]發(fā)現(xiàn)TG的沉默會導(dǎo)致兩種抗菌肽(甲殼素和溶菌酶)的表達量顯著下調(diào)，表明TG參與某些抗菌肽的表達調(diào)控。結(jié)果明確了凡納濱對蝦LvTGI和LvTGII均參與了抗病毒免疫反應(yīng)。然而，在兩種病毒感染下，LvTGI在不同組織中的表達量均受到抑制，關(guān)于LvTGI參與免疫反應(yīng)的機制還需進一步研究。

病毒往往需要克服甚至破壞宿主抗病毒免疫來獲得成功感染。WSSV和DIV1均能破壞對蝦血淋巴凝集反應(yīng)，且敲降凝血關(guān)鍵基因顯著增加了對蝦對病毒的易感性。因此，我們推測對蝦血淋巴的凝固作用可能與宿主抗病毒免疫反應(yīng)密切相關(guān)。本研究為進一步解析凝血系統(tǒng)參與宿主抗病毒免疫反應(yīng)的機理奠定了基礎(chǔ)。