陳路芳，李丹丹，倪 輝，楊遠(yuǎn)帆

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，今天的人類社會(huì)對(duì)健康提出了更高的要求。在預(yù)防和治療疾病方面，相對(duì)于傳統(tǒng)藥物，人們更傾向于食療的方式，中華食療科學(xué)已成為華夏飲食文化的重要內(nèi)容之一[1]。蜂蜜是蜜蜂利用自身分泌液將采集到的花蜜反復(fù)釀造而成的甜味物質(zhì)[2]。蜂蜜性味甘平，具有抗菌、抗氧化、補(bǔ)中益氣、養(yǎng)肺止咳、降低血脂水平等功效，對(duì)多種疾病起到調(diào)理、治療的作用，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[3]。我國蜂蜜生產(chǎn)量和出口量都穩(wěn)居世界第一，2018年蜂蜜產(chǎn)量為54.25萬t，出口量國際占比維持在19%以上[4]。

蜂蜜的主要成分是糖類，約占蜂蜜總質(zhì)量的75%，主要以葡萄糖、蔗糖及果糖為主[5]。研究表明，含糖食品在加工及儲(chǔ)藏過程中易發(fā)生焦糖化和美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)[6]，進(jìn)而分解成3-甲基-2-戊酮、糠醛等衍生物[7]。新鮮無添加的蜂蜜不含5-HMF，但隨著貯藏時(shí)間的延長，蜂蜜中部分葡萄糖和果糖在酸性條件下脫水生成5-HMF，若往蜂蜜中加入轉(zhuǎn)化糖等物質(zhì)，更容易產(chǎn)生5-HMF[2]。目前，人們通過測(cè)定蜂蜜中5-HMF含量來表征蜂蜜質(zhì)量，5-HMF成分高，表明蜂蜜純度不高，或者貯藏過久，或者貯藏環(huán)境不合理[8]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，蜂蜜中5-HMF含量要求不高于40 mg/kg[9]。目前，測(cè)定5-HMF含量的方法主要有紫外-可見分光光度法(spectrophotometry,SP)[10]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[12]和液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)[13]等。其中，GC-MS既有色譜較強(qiáng)的分離能力，同時(shí)具有質(zhì)譜靈敏的鑒別功能，具有高效率、靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)。近幾年來，頂空固相微萃取聯(lián)動(dòng)氣質(zhì)色譜(head space solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分析技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的采集、定量和定性分析等一系列研究，萃取過程不需要加入有機(jī)溶劑，抗干擾能力強(qiáng)，可更加準(zhǔn)確地分析樣品中的5-HMF等揮發(fā)性成分[14]。

由于蜂蜜中的5-HMF可以通過活性炭吸附等方法去除，因此，僅以5-HMF為指標(biāo)難以判別經(jīng)過活性炭處理的加熱濃縮蜂蜜的質(zhì)量，也不能很好地將新鮮純天然的原蜜與市場上其他濃縮蜜等加工蜂蜜區(qū)分開來。針對(duì)該問題，本文采用HS-SPME-GC-MS鑒定蜂蜜中5-HMF衍生物，建立定量檢測(cè)方法，對(duì)比分析原蜜和加熱濃縮蜂蜜樣品中5-HMF衍生物含量差異，為評(píng)價(jià)蜂蜜的質(zhì)量提供參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷、洋槐和龍眼原蜜均購于福建廈門本地商場。濃縮處理枇杷、洋槐、龍眼蜂蜜由本實(shí)驗(yàn)室在60～65 ℃溫度下加熱原蜜30 min得到[15]。

5-HMF、鹽酸，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；3-甲基-2-戊酮、糠醛、2-乙基-1-己醇、正構(gòu)烷烴、環(huán)己酮，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2010型Plus GC-MS儀、Rtx-5MS型毛細(xì)管色譜柱 (60 μm×0.32 mm，0.25 μm)色譜柱，日本島津公司；HH-157330-U型手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、30 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS、75 μm CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

量取5 mL樣品于SPME采集瓶中，加入25 mL水和10 μL內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮，立即密封混勻。于恒溫水浴鍋里60 ℃預(yù)熱保溫5 min，將老化后的固相微萃取頭萃取探針插入樣品瓶，頂空吸附20 min。隨后插入GC進(jìn)樣口解吸附3 min，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 5-HMF衍生物的制備

取適量5-HMF，按料液比(g∶mL)=1∶200的比例加入1.5 mol/L的鹽酸于90 ℃水浴鍋中催化90 min，然后立即冰浴冷卻，用氫氧化鈉溶液中和至pH=7，低溫避光保存。

1.3.3 5-HMF衍生物頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

為提高HS-SPME提取5-HMF衍生物的萃取效率，在鹽酸模擬體系下對(duì)樣品pH值、萃取頭、萃取溫度及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過不同萃取頭實(shí)驗(yàn)確定合適的pH值后，再考察萃取頭、萃取溫度及時(shí)間對(duì)峰面積的影響，確定最優(yōu)的萃取條件。

1)pH值的選擇。量取5份100 mL 5-HMF衍生物，用氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和，得到pH=4，5，6，7，8的5種樣品，低溫避光保存。分別量取5 mL上述5種樣品于采集瓶中，加入25 mL水，60 ℃預(yù)熱保溫5 min，插入75 μm CAR/PDMS萃取頭吸附20 min后進(jìn)行解析，測(cè)定各總峰面積。

2)萃取頭的選型。分別量取5 mL 5-HMF衍生物(pH=7)加入采集瓶中，加入25 mL水，60 ℃預(yù)熱保溫5 min，插入4種萃取頭吸附20 min后進(jìn)行解析，測(cè)定各總峰面積。

3)溫度的選擇。量取5 mL 5-HMF衍生物(pH=7)加入采集瓶中，加入25 mL水，預(yù)熱保溫5 min，插入75 μm CAR/PDMS萃取頭分別在30，45，60，75 ℃吸附20 min后進(jìn)行解析，測(cè)定各總峰面積。

4)時(shí)間的優(yōu)化。量取5 mL 5-HMF衍生物(pH=7)加入采集瓶中，加入25 mL水，60 ℃預(yù)熱保溫5 min，插入75 μm CAR/PDMS萃取頭在60 ℃下分別吸附10，20，30，40 min后進(jìn)行解析，測(cè)定各總峰面積。

1.3.4 5-HMF衍生物的分析條件

根據(jù)SCAN模式為掃描方式進(jìn)行定性分析，GC-MS條件參照本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)[16]。

1)GC條件。色譜柱為Rtx-5MS(60 m×0.32 mm，0.25 μm)，載氣為高純度氦氣，柱流量為3 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為250 ℃。柱升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持1 min。

2)MS條件。離子源溫度為200 ℃，電離方式為EI(electron ionization)，電離能量為0.80 kV，質(zhì)譜接口部分溫度為250 ℃，離子碎片掃描范圍將質(zhì)荷比設(shè)定為35～450，定量分析時(shí)質(zhì)譜掃描方式設(shè)為SIM(selected ion monitoring)模式。

3)定性分析。將正構(gòu)烷烴和樣品進(jìn)行GC-MS測(cè)定，采用儀器配置的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST08、NIST08s、FFNSC1.3)進(jìn)行檢索，檢測(cè)出揮發(fā)性成分匹配度較高(>80%)的化合物，結(jié)合基峰、特征峰、保留指數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)定性。根據(jù)式(1)計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)：

RIx=100n+100×(RTx-RTn)/(RTn+1-RTn)

(1)

其中：RIx為待測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)；n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；RTx為待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間；RTn為正構(gòu)烷烴Cn的保留時(shí)間。

1.3.5 5-HMF衍生物標(biāo)準(zhǔn)線性曲線的建立

3種5-HMF衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品采用已知濃度的內(nèi)標(biāo)物溶液(環(huán)己酮)進(jìn)行梯度稀釋，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.6 5-HMF衍生物的檢出限和定量限

將低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋得到一系列更低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照3倍信噪比(signal-noise ratio，S/N)即S/N=3的濃度作為方法檢出限，10倍信噪比即S/N=10的濃度作為方法定量限[17]。量取5 mL空白樣品，加入1 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(3種5-HMF混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，10 mg/L)和10 μL內(nèi)標(biāo)物(1 mg/L)，再逐倍稀釋至S/N=10，3。

1.3.7 5-HMF衍生物的回收率

分別向洋槐原蜜中添加已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻后進(jìn)行HS-SPME-GC-MS處理分析，以蜂蜜初始濃度為空白對(duì)照，各濃度平行測(cè)定3次，根據(jù)式(2)計(jì)算回收率：

回收率/%=[加標(biāo)樣測(cè)量值/(試樣測(cè)量值+加標(biāo)量)]×100。

(2)

1.3.8 5-HMF衍生物的準(zhǔn)確度和精密度

計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)來表示精密度，相對(duì)誤差(relative error,RE)反映準(zhǔn)確度[19]，根據(jù)式(3)計(jì)算：

準(zhǔn)確度/%=[(1-測(cè)量值的平均值/理論真實(shí)值)]×100。

(3)

1.3.9 加熱濃縮對(duì)5-HMF衍生物的影響

對(duì)6種蜂蜜樣品中5-HMF衍生物進(jìn)行HS-SPME/GC-MS檢測(cè)分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。蜂蜜樣品放在4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-HMF衍生物頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

由圖1a可知，當(dāng)pH=7時(shí)，分析得到的物質(zhì)峰面積最大，是萃取5-HMF衍生物的最佳pH值。由圖1b可知，比較4種萃取頭萃取效果，發(fā)現(xiàn)75 μm CAR/PDMS萃取頭可以更好吸附揮發(fā)性成分，因此選用75 μm CAR/PDMS的萃取頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖1c可知，萃取溫度從30 ℃到75 ℃，總峰面積隨溫度的增加呈現(xiàn)出先上升后略減少的趨勢(shì)。可能是因?yàn)榈蜏匚催_(dá)到5-HMF衍生物中部分揮發(fā)性成分的沸點(diǎn)，溫度升高，揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)性增強(qiáng)，有利于萃取頭對(duì)待測(cè)物質(zhì)的吸附[19]。60 ℃時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，萃取效率最高[20]，因此，采用60 ℃為萃取溫度。由圖1d可知，總峰面積隨萃取時(shí)間增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，20 min的萃取時(shí)間得到的總峰面積最大，因此選擇20 min為最佳萃取時(shí)間。

本文考察了萃取條件對(duì)揮發(fā)性成分提取效果的影響，確定HS-SPME萃取條件為：樣品的pH=7，75 μm CAR/PDMS的萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取時(shí)間為20 min。

2.2 蜂蜜樣品中5-HMF衍生物的鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

本文以洋槐原蜜為原料，經(jīng)HS-SPME-GC-MS分析后，得到蜂蜜中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖(見圖2)，從蜂蜜樣品中鑒定出3種5-HMF衍生物(見表1)。任佳淼等[21]、王方莉[22]、Rering等[23]分別在不同蜂蜜樣品中檢測(cè)到糠醛、3-甲基-2-戊酮與2-乙基-1-己醇，這說明本研究結(jié)果與相關(guān)蜂蜜研究具有一致性。

表1 6種蜂蜜樣品揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果

如表2所示，3-甲基-2-戊酮、糠醛和2-乙基-1-己醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=0.124X-5.820、

表2 5-HMF衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

Y=0.014 8X-0.757、Y=0.128X-7.935，相關(guān)系數(shù)均高于0.990，表明這3種5-HMF衍生物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。這3種5-HMF衍生物的檢出限和定量限結(jié)果見表2。李燕等[24]利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定8種食品中的5-HMF，其方法的檢出限為50 μg/kg，說明本方法靈敏度符合檢測(cè)要求。

2.3 方法回收率

分別往樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液25，50，100 mg/L，采用相同的方法處理。崔鈺瑩等[27]利用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵乳中4種糠醛類物質(zhì)，平均回收率范圍為82.2%～118%。本文中3-甲基-2-戊酮、糠醛和2-乙基-1-己醇的平均回收率范圍是80.76%～115.5%(見表3)，表明檢測(cè)方法重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)較可靠。

表3 蜂蜜中5-HMF衍生物的回收率

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

分別以相對(duì)誤差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，蜂蜜中檢測(cè)到的3種5-HMF衍生物的準(zhǔn)確度均接近100%，且平行性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.86%～8.02%。周斌等[28]利用GC-MS測(cè)定醬油中的糠醛類物質(zhì)，RSD為2.1%～8.3%。由此可見，本方法重復(fù)性良好，測(cè)定準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表4 方法準(zhǔn)確度和精密度

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

濃縮蜂蜜加工需要經(jīng)過融蜜、濃縮、滅菌等步驟[29]，這些步驟中溫度升高使果糖和葡萄糖脫水生成5-HMF，進(jìn)而轉(zhuǎn)換成5-HMF衍生物。隨著儲(chǔ)藏溫度的升高和時(shí)間的增加[30]，蜂蜜中5-HMF含量會(huì)增加，且溫度越高，增加速度越快[31]。對(duì)6種蜂蜜樣品中5-HMF衍生物進(jìn)行定量分析(見表5)可知，3-甲基-2-戊酮在龍眼原蜜中含量最高(55.11 μg/L)，在濃縮龍眼蜂蜜中含量最低(23.55 μg/L)；糠醛在濃縮枇杷蜂蜜中含量最高(563.4 μg/L)，在枇杷原蜜中最低(51.15 μg/L)；2-乙基-1-己醇在洋槐原蜜中含量最高(67.97 μg/L)，在枇杷原蜜中最低(63.55 μg/L)。通過比較可知，糠醛在3種原蜜中含量較低，但在對(duì)應(yīng)的濃縮蜂蜜中含量明顯升高；而3-甲基-2-戊酮和2-乙基-1-己醇含量在3種原蜜及對(duì)應(yīng)的濃縮蜜之間無顯著差異。結(jié)果表明，蜂蜜經(jīng)過加熱后，5-HMF及其衍生物含量會(huì)顯著增高。同時(shí)說明，在蜂蜜加熱過濾濃縮過程中產(chǎn)生的糠醛較穩(wěn)定，其在濃縮蜂蜜中的含量顯著高于原蜜的。因此，糠醛可作為區(qū)分加熱與非加熱蜂蜜的指標(biāo)物質(zhì)，為鑒別加熱蜂蜜與原蜜提供了新的參考指標(biāo)。

表5 6種市售樣品中5-HMF衍生物的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS分析蜂蜜中5-HMF衍生物，從市售原蜜及加熱濃縮處理之后的蜂蜜中鑒定出3-甲基-2-戊酮、糠醛和2-乙基-1-己醇3種5-HMF衍生物成分，其中，糠醛在3種加熱濃縮蜂蜜中的含量顯著高于對(duì)應(yīng)的3種原蜜，而3-甲基-2-戊酮及2-乙基-1-己醇含量在3種加熱濃縮蜂蜜與對(duì)應(yīng)原蜜之間沒有顯著差異。因此，蜂蜜中的糠醛含量可作為新鮮純天然的原蜜與市場上其他蜂蜜區(qū)分的參考指標(biāo)。