康潤澤，錢斯日古楞，倪巍洪，杜欣欣，于耀東，王紅英

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，大連 116034)

土霉素菌渣是龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)發(fā)酵生產(chǎn)土霉素過程中產(chǎn)生的酸性固態(tài)廢棄物，是在土霉素提取過程中，加入草酸等試劑酸化過濾后產(chǎn)生的[1]，因此呈酸性，主要含有土霉素生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基成分、生產(chǎn)用菌體和產(chǎn)品分離、提純所用的試劑以及殘留的土霉素等[2]。2008年抗生素菌渣列入《國家危險廢物名錄》，禁止用作飼料或飼料添加劑[3]。土霉素菌渣含水量高、熱值低，在烘干和焚燒過程中需要大量的外部熱量和燃料，因此其處置成本較高[4-6]。我國雖沒有明文規(guī)定抗生素菌渣不能作為肥料使用，但其存在菌渣處理不完全、制備的有機(jī)肥可能含有的抗生素殘留或代謝中間產(chǎn)物，在生物體內(nèi)累積，產(chǎn)生抗藥性等潛在的生態(tài)風(fēng)險[7-9]。如何在環(huán)境友好、安全的前提下，合理有效地利用菌渣是目前亟待解決的重要課題[10-11]。

本研究通過篩選能夠耐受土霉素菌渣并能產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶的菌株，旨在利用該菌株對土霉素菌渣進(jìn)行發(fā)酵處理，充分利用菌渣成分，獲得可再利用的發(fā)酵液，作為培養(yǎng)基成分重新利用于土霉素生產(chǎn)中，在節(jié)省資源的同時，達(dá)到菌渣的無害化處理目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

土霉素菌渣和土霉素菌渣堆肥，均由內(nèi)蒙古華曙生物科技有限公司提供。

1.1.2 試劑與儀器

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥95%)，北京索萊寶科技有限公司銷售；蔗糖、賴氨酸、Folin-酚試劑、茚三酮、重鉻酸鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純。TU-1901紫外分光光度計，北京譜析通用儀器公司；TGL-16K高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱MJ-16085-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZHWY2102C立式雙層恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

5%菌渣培養(yǎng)基：稱取干燥的400目土霉素菌渣粉末5 g加到100 mL自來水中混勻，pH值自然，用高壓滅菌鍋滅菌121 ℃，20 min，備用。配制5%的菌渣固體培養(yǎng)基需要加入5 g瓊脂以確保凝固性。

10%菌渣培養(yǎng)基：稱取干燥的400目土霉素菌渣粉末10 g加到100 mL自來水中混勻，pH值自然，用高壓滅菌鍋滅菌121 ℃，20 min，備用。

察氏液體培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。121 ℃，20 min滅菌備用。固體察氏培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

1.2.2 菌株的篩選

用無菌水浸泡土霉素菌渣堆肥樣品，得到的浸出液在察氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，30 ℃下培養(yǎng)，獲得菌落。

將察氏培養(yǎng)基上生長出的不同單菌落，分別在5%菌渣固體培養(yǎng)基上劃線接種，在30 ℃條件下培養(yǎng)，分別獲得M-1、M-2的單一菌落。

1.2.3 篩選菌株的生長曲線

制備孢子懸液：分別選擇在察氏培養(yǎng)基上長勢良好且孢子旺盛的M-1、M-2菌株，分別刮取孢子，用無菌水制成2.0×106個/mL的M-1和M-2的孢子懸液。

在裝有100 mL察氏培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，分別接入1 mL的M-1、M-2孢子懸液。每種菌做3組平行，每組13瓶。30 ℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)。每隔12 h取出6瓶，5 000 r/min離心10 min，稱量菌絲濕重，繪制生長曲線。

1.2.4 篩選菌株的酸、堿耐受性

分別配制pH值為2、3、4.5、6.5、7、8的100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基。分別接入1 mL的M-1、M-2的孢子懸液，每個梯度平行做3組，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。5 000 r/min離心10 min，稱量菌絲濕重，考察菌株的土霉素耐受性。

1.2.5 篩選菌株的土霉素耐受性

配制含有土霉素0、200、600、1 000、1 400和1 800 u/mL，pH 3的察氏液體培養(yǎng)基各100 mL，分別加入250 mL錐形瓶中。吸取1 mL的M-1、M-2的孢子懸液接入不同土霉素含量的察氏液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。用5 000 r/min離心10 min，獲得濕菌絲，稱重，分析并比較土霉素對菌體生長的影響，考察其土霉素耐受性。

1.2.6 菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化

(1)菌株產(chǎn)蛋白酶活力的測定。以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，F(xiàn)olin-酚試劑為顯色劑，在660 nm處測定吸光值，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程式為y=127.22x-1.948 8，R2=0.997 4。

取一支試管，加入1 mL酪蛋白溶液(2%，pH 6.5磷酸鹽緩沖液配制)，置入40 ℃水浴中預(yù)熱5 min，再加入1 mL 40 ℃預(yù)熱5 min的樣品溶液，混勻后在40 ℃水浴中保溫10 min。立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，搖勻，保溫20 min。離心，吸取上清液1 mL，加入5 mL的0.5 mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1 mL Folin-酚試劑，于40 ℃水浴中顯色20 min。在660 nm波長下測吸光度。

酶活定義為在40 ℃，pH 6.5條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 mg酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位(u)。

(2)菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化。為了優(yōu)化產(chǎn)酶條件，以蛋白酶活力為依據(jù)，在察氏培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)時間進(jìn)行研究。在菌渣培養(yǎng)基中，對菌渣添加量、接種量和裝液量等因素進(jìn)行研究。

1.2.7 篩選菌株對土霉素菌渣的轉(zhuǎn)化

(1)菌渣整體質(zhì)量的變化。在含有100 mL 5%菌渣液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，分別加入8 mL的M-1、M-2的孢子懸液和無菌水，平行3組。在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105 ℃條件下烘干至恒重，冷卻后精確稱量其重量。

(2)菌渣蛋白質(zhì)含量的變化。培養(yǎng)方法同上。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105 ℃條件下烘干至恒重，用凱式定氮法測定其蛋白含量。

(3)菌渣的游離氨基酸變化影響。培養(yǎng)方法同上。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，定容至一定體積，并測定其游離氨基酸含量。游離氨基酸的測定，以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)物，茚三酮為顯色劑，在565 nm波長處測吸光值，得到回歸方程式為y=304.74x+7.299 1，R2=0.999 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

分離純化獲得兩種霉菌，分別命名為M-1和M-2，菌落形態(tài)如下圖。經(jīng)初步鑒定M-1為米曲霉、M-2為綠色木霉。

圖1 篩選菌株菌落形態(tài)

2.2 篩選菌株的生長曲線

將篩選菌株接種到液體察氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后分別取樣測定菌絲濕重，以菌絲濕重值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。由圖2可見，培養(yǎng)開始24 h后，兩種菌株的菌絲重量均急劇上升，此時菌種進(jìn)入快速增長期。在72 h時，菌株M-1到達(dá)增長高點，隨后菌絲濕重?zé)o明顯變化，進(jìn)入緩慢衰亡期；而菌株M-2在108 h時菌絲濕重達(dá)增長高點，隨后進(jìn)入衰亡期。

圖2 篩選菌株生長曲線

2.3 篩選菌株的酸、堿耐受性

由圖3可知，M-1和M-2分別在pH 3和pH 6.5表現(xiàn)出最佳的生長量，均呈現(xiàn)出良好的耐酸性。M-1耐酸性好于M-2。兩種菌對堿性環(huán)境耐受性較差。

圖3 pH值對菌體生長的影響

土霉素菌渣的pH在3.35到3.77之間呈酸性。兩種霉菌都可以在樣品的pH范圍內(nèi)生長，滿足了處理土霉素菌渣的必要條件。

2.4 篩選菌株的土霉素耐受性

從圖4可知，M-1土霉素耐受性好于M-2。土霉素濃度低于1 800 u/mL時，對兩種霉菌的影響有限，兩株霉菌可以在較高濃度的土霉素環(huán)境下均生長良好。菌渣里土霉素殘留在416.6 u/mL左右，遠(yuǎn)低于1 800 u/mL的土霉素濃度，所以兩種菌株在處理土霉素菌渣時，不會被土霉素抑制繼而影響處理效率。

圖4 土霉素濃度的變化對菌體生長的影響

2.5 菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化

2.5.1 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響

向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中，分別接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，初始pH值分別設(shè)定為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，平行3組，在30 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)168 h，分別取樣測定酶活，考察pH值變化對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值小于6.0時，菌株M-1和M-2均隨著pH值的增大其產(chǎn)蛋白酶活力快速增加，pH值大于7.0時，隨著pH值的增大其酶活力快速下降；菌株M-1在pH 6.0時，蛋白酶活力達(dá)到最高值，菌株M-1在pH6.5時其酶活達(dá)到最高。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適初始pH值分別確定為6.0和6.5。

2.5.2 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響

向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中，分別接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，pH值為 6.5，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，平行3組。在轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)168 h，分別取樣，測定酶活，考察溫度的變化對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖6。

圖6 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

在30 ℃以下培養(yǎng)時，菌株M-1和M-2產(chǎn)生蛋白酶活力隨著溫度的升高而增大，溫度達(dá)到30 ℃時，它們酶活力均達(dá)到最高，而后隨溫度的提高酶活力下降。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適溫度確定為30 ℃。

2.5.3 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

分別向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中接入1 mL M-1孢子懸液、1 mL M-2孢子懸液，pH值為6.5，平行3組。在30 ℃轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)192 h。每隔24 h分別取樣測定酶活，考察培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖7。

圖7 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)到48 h時，菌株M-1、M-2均開始產(chǎn)蛋白酶，培養(yǎng)至72 h時，酶積累量開始增大。在168 h時M-1產(chǎn)酶活力達(dá)到最高值，而M-2在144 h時酶活達(dá)到最高；在最高點之后，兩種菌的產(chǎn)酶活性隨之緩慢下降。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適培養(yǎng)時間分別確定為168 h和144 h。

2.5.4 菌渣添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響

分別在100 mL/250 mL蒸餾水中加入5、10、15、20、25 g的400目土霉素菌渣粉末，分別向其中接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)144 h，分別測定酶活，考察菌渣添加量對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖8。

圖8 菌渣添加量對菌株產(chǎn)酶的影響

菌渣添加量為5%～10%，M-1產(chǎn)蛋白酶的活力隨菌渣添加量的增大而增加，10%達(dá)到最高。M-2產(chǎn)蛋白酶活力在5%時達(dá)到最高，在10%時也保持了較高的酶活力。隨后，兩種菌的酶活力隨著菌渣添加量的增大而快速下降。在菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基中添加過多菌渣不利于其產(chǎn)生蛋白酶，這可能是菌渣中的一些成分影響了菌的產(chǎn)酶活性。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶的最適菌渣添加量分別確定為10%和5%。

2.5.5 接種量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響

在100 mL/250 mL 5%的菌渣培養(yǎng)基中，分別接種1、3、5、7和9 mL的M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)144 h，分別取樣測定酶活，考察接種量對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖9。

圖9 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

菌株M-1的產(chǎn)蛋白酶活力隨接種量的提高而增加，直至接種量為5 mL時其酶活力達(dá)到最高值，隨后其產(chǎn)酶活力逐漸下降，這可能是因為增加初始菌體的量導(dǎo)致菌體生長加快、發(fā)酵周期縮短。菌株M-2開始時，隨著接種量的加大其蛋白酶活力逐漸增加。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶的最適接種量分別確定為5%和9%。

2.5.6 裝液量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響

在250 mL的錐形瓶中分別加入5%的菌渣培養(yǎng)基20、40、60、80和100 mL，分別按照5%和9%的接種量接入M-1、M-2的孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)144 h，分別取樣測定酶活，考察裝液量對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖10。

圖10 裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

菌株M-1在裝液量低于40 mL時，其產(chǎn)生蛋白酶活力隨裝液量的加大而增加，在裝液量為40 mL時酶活達(dá)到最高，而后其酶活下降。菌株M-2的產(chǎn)蛋白酶活力隨著裝液量的增加而逐漸提高。所以，在250 mL錐形瓶中，M-1、M-2的最佳裝液量確定為40 mL和100 mL。

2.6 菌株在優(yōu)化菌渣培養(yǎng)條件下的產(chǎn)蛋白酶活力測定

M-1的優(yōu)化培養(yǎng)條件：在250 mL錐形瓶中，40 mL裝液量，10%菌渣添加量，5%接種量，pH值6.0，30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)168 h；M-2的優(yōu)化培養(yǎng)條件：在250 mL錐形瓶中，100 mL裝液量，5%菌渣添加量，9%接種量，pH值6.5，30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)144 h。發(fā)酵結(jié)束后，測定蛋白酶活力。結(jié)果見表1。

表1 篩選菌株產(chǎn)蛋白酶活力

在菌渣培養(yǎng)基中，菌株M-2在其最適產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵上清液中蛋白酶活為44.41 u/mL，菌株M-1在其最適產(chǎn)酶條件下產(chǎn)蛋白酶活性達(dá)到99.33 u/mL，比菌株M-2的高出1.24倍。

2.7 篩選菌株對土霉素菌渣的轉(zhuǎn)化

篩選菌株對菌渣成分的轉(zhuǎn)化研究中，共考察了菌渣總重量、蛋白成分的變化和發(fā)酵后游離氨基酸的變化等內(nèi)容，結(jié)果見表2。

表2 菌渣活性成分的變化

菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時，對菌渣成分能夠有效轉(zhuǎn)化；其中M-1對總物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到6.21%，其中對菌渣蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化尤為明顯達(dá)到12.79%；菌渣經(jīng)M-1發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量有明顯的提升，由原來7.14 mg增加到222.07 mg，提高了30倍。結(jié)果表明，篩選菌株M-1在簡單的菌渣培養(yǎng)基中能很好地生長，而且對菌渣蛋白質(zhì)有較好的水解和轉(zhuǎn)化活性。菌株M-2對菌渣總物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.4%，對菌渣蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化達(dá)到3.65%，菌渣經(jīng)M-2發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量有較好的提升，由原來7.14 mg增加到49.26 mg，提高了6倍。經(jīng)M-1處理后的菌渣所減少的質(zhì)量大部分是蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化所致，而M-2處理后的菌渣減少的質(zhì)量部分是轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)，另外一部分是被水解的其他物質(zhì)減少的量。

3 結(jié)論

本實驗篩選出兩株M-1、M-2，經(jīng)初步鑒定M-1為米曲霉菌，M-2為綠色木霉菌。M-1在pH 3、M-2在pH 6.5時生長量最大，均表現(xiàn)出良好的酸耐受性。兩株霉菌在土霉素濃度1 800 u/mL的條件下生長良好，具有較好的土霉素耐受性。菌渣pH值及土霉素殘留量對其生長沒有抑制作用，適合應(yīng)用于土霉素菌渣的處理[12]，對堿性環(huán)境耐受性較差。兩株霉菌對處理菌渣是有效的，M-1的處理效果好于M-2。M-1對菌渣蛋白質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化率達(dá)到12.79%，游離氨基酸含量提高了30倍；菌渣經(jīng)M-2發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量提高了6倍。

篩選菌株可在酸性的菌渣環(huán)境中生長，可對生產(chǎn)菌渣進(jìn)行發(fā)酵處理，可以得到蛋白質(zhì)水解液，用水解液部分替代土霉素生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進(jìn)行生產(chǎn)土霉素，可降低生產(chǎn)成本；同時達(dá)到菌渣的回收利用和無害化處理目的。對含大量抗生素殘留、成分復(fù)雜、難降解的危險污染物菌渣，目前還缺乏高效、節(jié)能、環(huán)境友好型的處理方法。土霉素菌渣中的蛋白質(zhì)含量可達(dá)到43.88%，利用兩株霉菌生長及代謝的不同，如果實現(xiàn)兩種菌株的混合培養(yǎng)，作為互補進(jìn)而加強對菌渣的處理能力，對危險菌渣的無害化處理及資源的再利用方面具有重大價值[13]，這有待進(jìn)一步研究。