李方琳，王慧慧，粟雨芯，馬忠仁*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

人流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，流感病毒每年感染率高達(dá)5%～10%，老年人是高危人群[1-2]。因此，流感在威脅公共健康的同時(shí)，也增加了國(guó)家和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。血凝素（Hemagglutinin,HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,NA）是流感病毒2種表面抗原，其抗原性強(qiáng)，容易變異，致使人群對(duì)新毒株的免疫力下降，給疫苗研制與生產(chǎn)帶來(lái)了挑戰(zhàn)[4]。目前，接種流感疫苗是預(yù)防和控制流感最為有效的措施，及時(shí)接種流感疫苗，既能減少流感病毒感染，又能減輕流感癥狀[5]。DNA疫苗因其免疫效果好、危險(xiǎn)性低、價(jià)格低廉、易于貯藏和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[6-9]。近年來(lái)，流感病毒的DNA疫苗研究取得了較大進(jìn)展。針對(duì)人流感分離株H5N1的DNA疫苗研究結(jié)果表明，該研究中所構(gòu)建的H5N1的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)[10]。此外，有學(xué)者已經(jīng)成功構(gòu)建出2013年暴發(fā)的禽流感的病原體H7N9的DNA疫苗[11]。本試驗(yàn)旨在構(gòu)建甲型流感病毒（H1N1）血凝素（HA）的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1(+)-HA），為后續(xù)其作為DNA疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上皮細(xì)胞系（293T）由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心凍存?zhèn)鞔?；E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備；引物由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成，熒光定量?jī)?nèi)參為GAPDH。

1.2 主要試劑

DL10000 Marker、DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I均購(gòu)于TAKARA生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑（北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司），TreliefTM SoSoo Cloning Kit（北京擎科生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（蘭州民海生物工程有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)染試劑（Invigentech公司）；總RNA提取試劑（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；β-Actin、抗甲型流感H1N1 HA抗體（兔源，Abcam)；山羊抗兔IgG抗體（HRP標(biāo)記，Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的擴(kuò)增與連接 采用PCR技術(shù)，以H1N1流感病毒cDNA為模版，上游引物為5’-TGGAAATGGCTGCTTCGAGT-3’、下游引物為5’-TTGCCTCCTCGCTGTACTTG-3’，擴(kuò)增目的基因大小為1 700 bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行回收與純化。

用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I按表1反應(yīng)體系酶切pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化、回收線性載體和目的基因后，用TreliefTM SoSoo Cloning Kit進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物即重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-HA。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，37 ℃、200～220 rpm放大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

表1 雙酶切反應(yīng)體系（20 μl）

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光定量 293T細(xì)胞由含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%左右時(shí)，使用Invigentech公司轉(zhuǎn)染試劑按照操作說(shuō)明書將pcDNA3.1 (+)與成功構(gòu)建的pcDNA3.1 (+)-HA重組質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑按照1∶1混勻，混合液于室溫孵育10～15 min后，加入含有完全培養(yǎng)基的293T細(xì)胞中培養(yǎng)24 h后，換液培養(yǎng)至48 h，其中以不轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組，pcDNA3.1 (+)轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照組。隨后提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)熒光定量觀察HA基因在293T細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)情況。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)HA的表達(dá) 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)PBS清洗數(shù)次，收集細(xì)胞并加入RIPA裂解液500 μl（含有1%的PMSF），抽提蛋白。用BCA法定量，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗，二抗4 ℃過(guò)夜孵育后，顯影拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒鑒定

設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為1 700 bp左右，與預(yù)期大小相符（圖1A）。重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I酶切后，電泳結(jié)果出現(xiàn)1 700 bp的目的條帶（圖1B）。結(jié)果表明pcDNA3.1 (+)-HA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 HA PCR產(chǎn)物電泳及pcDNA3.1 (+)-HA雙酶切

2.2 HA基因mRNA表達(dá)水平

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后的熒光定量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞內(nèi)HA的mRNA表達(dá)顯著上升（P＜0.000 1，圖2），這一結(jié)果也進(jìn)一步表明pcDNA3.1 (+)-HA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并且能在293T細(xì)胞中表達(dá)。pcDNA3.1 (+)-HA轉(zhuǎn)染組HA的mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照及空載轉(zhuǎn)染組（P＜0.000 1，圖2）。

圖2 pcDNA3.1 (+)-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后HA mRNA表達(dá)

2.3 Western blot驗(yàn)證pcDNA3.1 (+)-HA在293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h提取蛋白，經(jīng)Western Blot檢測(cè)HA蛋白的表達(dá)。圖3表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-HA重組質(zhì)粒組，出現(xiàn)特異性條帶，即HA蛋白，而未轉(zhuǎn)染及空載組無(wú)條帶，與mRNA水平一致（圖2），說(shuō)明真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HA蛋白的表達(dá)明顯增加。

圖3 Western Blot檢測(cè)pcDNA3.1 (+)-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后HA的蛋白表達(dá)

3 討論與結(jié)論

甲型流感病毒傳染性較強(qiáng)，容易形成大流行。HA是流感病毒表面主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是甲型流感病毒主要的表面抗原，它能產(chǎn)生保護(hù)人類的中和抗體[12]，因此是疫苗開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)[13]，也是DNA疫苗的聚焦點(diǎn)。重組質(zhì)粒是研究基因功能的常用手段之一，也是DNA疫苗的主要技術(shù)。DNA疫苗作為新興的生物技術(shù)產(chǎn)品已被充分肯定，應(yīng)用前景較好。

為了進(jìn)一步研究DNA疫苗的免疫效果，本研究通過(guò)P C R 等技術(shù)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-HA，驗(yàn)證后將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后對(duì)細(xì)胞內(nèi)HA進(jìn)行mRNA及蛋白水平檢測(cè)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)無(wú)論是mRNA水平，還是蛋白表達(dá)水平都顯著增加，證明成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)-HA，可為后續(xù)DNA的研究提供材料。