洛松西熱，王玉恒，吉哈利，于子淇，胡劍武，旦增卓瑪

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)獸醫(yī)局，西藏 拉薩 850000；3.西藏蓮莖生物科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

西藏自治區(qū)位于青藏高原西南部，動(dòng)物資源尤為豐富，其中大中型野生動(dòng)物數(shù)量居全國(guó)第一。養(yǎng)殖牛羊可為西藏農(nóng)牧民帶來(lái)經(jīng)濟(jì)收入，但小反芻獸疫、牛結(jié)節(jié)性皮膚病等重大動(dòng)物疫病會(huì)影響?zhàn)B殖效益，因此進(jìn)行動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)尤為重要[1]。目前酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是動(dòng)物疫病抗體的主要檢測(cè)方法。血清抗體是一種免疫蛋白，其蛋白質(zhì)量會(huì)直接影響動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。由于西藏地廣、道路崎嶇、養(yǎng)殖戶分散等原因，導(dǎo)致樣品運(yùn)輸時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，有可能會(huì)影響抗體檢測(cè)結(jié)果[3-5]。目前，傳統(tǒng)樣品運(yùn)輸方式為泡沫箱加冰袋，這種方法雖然便捷，但受外圍環(huán)境影響有一定時(shí)限性，可能會(huì)對(duì)血清抗體檢測(cè)結(jié)果造成一定影響[6-8]。因此，探究泡沫箱的保溫效果及其對(duì)血清檢測(cè)結(jié)果的影響尤為重要。

本試驗(yàn)?zāi)M不同運(yùn)輸溫度，采用傳統(tǒng)運(yùn)輸方式探究泡沫箱內(nèi)溫度變化以及保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，為動(dòng)物疫病檢測(cè)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小反芻獸疫活疫苗（Clon9株）由西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠提供，批號(hào) 202101；小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒采購(gòu)于青島立見生物科技有限公司，批號(hào)20172107。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)分析儀采購(gòu)于北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)DNM-9602；恒溫培養(yǎng)箱采購(gòu)于上海鴻都科技有限公司，型號(hào)SHP-300；高速冷凍離心機(jī)采購(gòu)于湖南星科科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)TGL16；4 ℃冰箱采購(gòu)于海爾集團(tuán)，型號(hào)BCD-223WDPT；溫度計(jì)經(jīng)深州天溯計(jì)量檢測(cè)股份有限公司校驗(yàn)，校驗(yàn)證書編號(hào)Z20211-G208274，其他耗材均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 樣品來(lái)源

試驗(yàn)動(dòng)物為20頭2～3月齡的西藏本地山羊，按照小反芻獸疫疫苗免疫劑量說(shuō)明書進(jìn)行頸部皮下免疫。免疫21 d后，頸靜脈采全血10 ml，4 ℃ 10 000 r/min，5 min分離血清。將10份血清樣品分裝為3份，保存于1.5 ml離心管。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組，分別為4 ℃試驗(yàn)組、25 ℃試驗(yàn)組、37 ℃試驗(yàn)組。在3個(gè)泡沫箱（內(nèi)尺寸250 mm×110 mm×130 mm；外尺寸300 mm×140 mm×230 mm）中分別放入10份山羊血清樣品和3個(gè)冰袋（約300 g），放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱和4 ℃冰箱。將溫度計(jì)插入泡沫箱內(nèi)，定期觀察溫度變化。

1.4.2 抗體檢測(cè)方法 在血清樣品放置0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，分別取出少量血清用于抗體檢測(cè)。根據(jù)小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。先在陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔各加入50 μl陰、陽(yáng)性對(duì)照樣品和樣品稀釋液，樣品檢測(cè)孔加入25 μl樣品稀釋液和25 μl血清樣品，震蕩混勻，37 ℃孵育60 min，每孔加入300 μl洗滌液，洗滌4次。然后每孔加入50 μl酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育30 min，再加入300 μl洗滌液，洗滌4次，再加入50 μl底物溶液，室溫避光孵育15 min。最后每孔加入50 μl終止液，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值。

1.4.3 抗體檢測(cè)判定方法 標(biāo)準(zhǔn)樣品判定：陽(yáng)性對(duì)照樣品抑制率（PI）=（1-陽(yáng)性對(duì)照孔吸光值/空白對(duì)照孔吸光值）×100%＞60%；陰性對(duì)照樣品抑制率（PI）=（1-陰性對(duì)照孔吸光值/空白對(duì)照孔吸光值）×100%＜40%；結(jié)果判定：樣品抑制率（PI）=（1-待檢樣品吸光值/空白對(duì)照孔吸光值）×100%，PI＞50%為陽(yáng)性，PI≤50%為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2010版軟件對(duì)試驗(yàn)羊的血清樣品抗體水平進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 不同環(huán)境溫度對(duì)泡沫箱內(nèi)的溫度影響

2.1.1 4 ℃環(huán)境溫度對(duì)泡沫箱內(nèi)的溫度影響 由圖1可知，當(dāng)環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)較平緩，其中在16～20 h泡沫箱內(nèi)溫度維持在最低溫度（1 ℃），在56 h達(dá)到最高溫度（5 ℃），其余時(shí)間段均維持在2～4 ℃。

圖1 4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

2.1.2 25 ℃環(huán)境溫度對(duì)泡沫箱內(nèi)的溫度影響 由圖2可知，當(dāng)環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)為階段性升高，其中在4～40 h泡沫箱內(nèi)溫度維持在9～12 ℃，在40～56 h泡沫箱內(nèi)溫度上升至20 ℃，在56～72 h泡沫箱內(nèi)溫度維持在22～25 ℃。

圖2 25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

2.1.3 37 ℃環(huán)境溫度對(duì)泡沫箱內(nèi)的溫度影響 由圖3可知，當(dāng)環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)為對(duì)數(shù)性升高，其中在4～20 h泡沫箱內(nèi)溫度升高至20 ℃，在24～40 h泡沫箱內(nèi)溫度升高至30 ℃，在40～72 h時(shí)泡沫箱內(nèi)溫度升高至38 ℃。

圖3 37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，陽(yáng)性對(duì)照組抑制率（PI）為88.59%＞60%，陰性對(duì)照組抑制率（PI）為4.52%＜40%。根據(jù)樣品判定標(biāo)準(zhǔn)可知，本次試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照成立，進(jìn)一步表明可根據(jù)試劑盒內(nèi)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)血清樣品進(jìn)行判定。

表1 陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

由表2、表3可知，運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)為12 h時(shí)，4 ℃試驗(yàn)組、25 ℃試驗(yàn)組和37 ℃試驗(yàn)組的平均吸光值均維持在0.025，平均阻斷率（PI）均為80%；運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)為24～36 h時(shí)，4 ℃試驗(yàn)組和25 ℃試驗(yàn)組的平均吸光值和平均阻斷率相差不大，但均比37 ℃試驗(yàn)組的平均阻斷率低2%～3%；運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)超過(guò)48 h時(shí)，4 ℃試驗(yàn)組的平均阻斷率基本穩(wěn)定，但25 ℃試驗(yàn)組和37 ℃試驗(yàn)組的平均阻斷率均下降2%～5%。

表2 不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)樣品吸光值的影響

表3 不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)樣品阻斷率的影響

3 討論

在小反芻獸疫、牛結(jié)節(jié)性皮膚病等動(dòng)物疫病的流行下，對(duì)牛羊等動(dòng)物抗體效價(jià)檢測(cè)尤為重要[1]。只有評(píng)估抗體效價(jià)才能真正監(jiān)控牛羊等動(dòng)物群體的免疫動(dòng)態(tài)。由于溫度、時(shí)間等運(yùn)輸條件會(huì)對(duì)血清樣品質(zhì)量造成一定影響[2-5]，所以對(duì)運(yùn)輸條件的探索有重要意義。本試驗(yàn)?zāi)M4 ℃、25 ℃和37 ℃外界環(huán)境條件，探索泡沫箱內(nèi)溫度變化。結(jié)果顯示當(dāng)環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)較平緩；當(dāng)環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)為階段性升高，在56～72 h泡沫箱內(nèi)溫度維持在22～25 ℃；當(dāng)環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)為對(duì)數(shù)性升高，在24～40 h泡沫箱內(nèi)溫度升高至30℃，在40～72 h泡沫箱內(nèi)溫度升高至38 ℃。結(jié)果表明，外界溫度為4 ℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度會(huì)維持在6 ℃以下；外界溫度為25 ℃時(shí)，在24 h內(nèi)泡沫箱內(nèi)溫度會(huì)維持10 ℃以下；外界溫度為37 ℃時(shí)，在8 h內(nèi)泡沫箱內(nèi)溫度會(huì)維持15 ℃以下，進(jìn)一步表明外界環(huán)境溫度與泡沫箱內(nèi)溫度密切相關(guān)。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)血清抗體水平的影響，結(jié)果表明隨著運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)的增加，4 ℃試驗(yàn)組的平均吸光值和平均阻斷率基本維持不變；在運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)超過(guò)48 h時(shí)，25 ℃試驗(yàn)組的平均阻斷率會(huì)降低2%～3%；運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)超過(guò)24 h時(shí)，37 ℃試驗(yàn)組的平均阻斷率會(huì)降低2%～5%。不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)血清抗體檢測(cè)結(jié)果充分表明，泡沫箱加冰袋的傳統(tǒng)運(yùn)輸方法運(yùn)輸血清樣品時(shí)，運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)不宜超過(guò)12 h，才能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。