李連瑞，陳志勇，劉婕，李天祥

（1．天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，天津 300400；2．天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，在糖尿病人群中DN患病率約20%～40%[1]。其病理改變臨床常以微量白蛋白尿/蛋白尿、腎功能減退等典型表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)在DN早期進行有效的治療，可逆轉腎臟損害，減少進入終末期腎病的發(fā)生發(fā)展[1]。目前，DN暫時仍沒有特效藥物，雷帕霉素是一種免疫抑制劑，是DN的常用藥，通過與細胞FK506結合蛋白結合后特異性阻斷雷帕霉素把分子（mTOR），參與多種免疫抑制達到腎臟保護的作用，但是研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素有明顯的毒副作用[2]。在臨床實踐中，中醫(yī)藥治療DN體現(xiàn)出比西藥更好的優(yōu)勢，可延緩DN的進展。因此，本課題擬通過檢測DN模型大鼠結締組織生長因子（CTGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）信號通路研究乾坤丹Ⅵ號對DN的作用，明確其治療作用及機制，為其開發(fā)上市中藥復方制劑提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性Wistar大鼠40只，體質量（200±20）g，高糖高脂飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司；注射用鏈佐霉素（STZ，美國Sigma公司，貨號S0130）；全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號BC3711）；小鼠抗CTGF單克隆抗體（美國SANTA公司，貨號sc-373936）；兔抗TGF-β1單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab215715）；小鼠抗BMP-7單克隆抗體（美國SANTA公司，貨號sc-53917）；ECL化學發(fā)光法檢測試劑盒[小鼠免疫球蛋白G（IgG），北京索萊寶科技有限公司，貨號SW2010]；總RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號R1200）；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號RP1100）；PCR引物由寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司合成，引物序列為：CTGF上游：CACCC GGGTTACCAATGACA、下游：AAGGTTCTGACTCC CGACC，TGF-β1上游：CTCCCGTGGCTTCTAGTGC、下游：GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG，BMP-7 上游：GGAAGCGTGCAAGGCATTAG、下游：CTCACCG ACCTCTTCTGAGC，β-actin上游：CTGAACGTGAAA TTGTCCGAGA、下游：TTGCCAATGGTGATGACCTG。乾坤丹Ⅵ號由天津市北辰中醫(yī)醫(yī)院藥劑科自行制備。

1.2 實驗儀器 羅氏血糖儀，LEGEND MICRO 21R臺式高速冷凍離心機（美國THERMO公司），分光光度計（美國THERMO公司），StepOne Software熒光定量PCR儀（美國Applied biosystems公司），BG-subMIDI電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（美國 BIO-Rad公司），StepOne Software（美國UPV公司）。

1.3 動物模型制備 采用雄性Wistar大鼠40只，隨機抽取30只，依照文獻方法[3]，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，60 mg/kg），同時給予高糖高脂飼料，建立糖尿病大鼠模型，以造模后1周糖尿病模型大鼠隨機血糖≥16．7 mmol/L提示糖尿病模型建立成功；以24 h尿蛋白定量≥30 mg提示DN模型建立成功，成模率在90%以上。并隨機分為模型組、乾坤丹Ⅵ號組、陽性對照組，每組10只；其余10只大鼠作為空白對照組。

1.4 藥物治療 試藥組灌胃給予乾坤丹Ⅵ號水溶液，通過表觀分布容積計算得來，成人用量為每次12g，每日3次，即每日36g。成人平均體質量為60kg，即0．6 g/（kg·d）。大鼠表觀分布容積為人的6～9倍，0．6 g/（kg·d）×6=3．6 g/（kg·d）。每日用藥量改為3．6 g/（kg·d），陽性對照組灌胃給予雷帕霉素[0．2 mg/（kg·d）]，模型組和空白對照組給于等體積蒸餾水。連續(xù)給藥12周后處死，采用促凝管腹主動脈取血，取尿液備用，取腎臟并將其分為兩部分，一部分4%多聚甲醛溶液固定，另一部分置于液氮之中保存。

1.5 檢測指標

1.5.1 血糖檢測 1．4中所采集動物血液于半徑為13．5 cm離心機中3 000 r/min離心10 min，取上層血清，采用羅氏血糖儀及相應試紙，依照血糖儀說明書方法檢測實驗動物血清中血糖，以評價糖尿病治療情況。

1.5.2 尿微量白蛋白檢測 使用上文中所采集血清，采用大鼠尿微量白蛋白（mALB）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（貨號 ml059011），依照試劑盒說明書方法檢測實驗動物尿微量白蛋白，以評價腎功能的改變。

1.5.3 腎臟病理檢測 取多聚甲醛溶液固定的腎臟組織，脫水、石蠟包埋，切片，并進行蘇木精-伊紅（HE）染色，于顯微鏡400倍視野下觀察腎小球病理改變情況。

1.5.4 Westernblotting法檢測 CTGF、TGF-β1、BMP-7等因子蛋白的表達 液氮保存的腎臟組織加液氮進行勻漿，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），500×g離心5 min；吸干殘留的PBS，估計樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻；冰浴中以最大功率超聲破碎細胞（3×10 s）；4 ℃，12 000 r/min 離心 15 min，離心半徑10 cm，收集上清液；BCA蛋白定量法測定蛋白濃度根據蛋白定量結果，加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣Buffer混合，95℃變性10 min，立即置于冰中待用；蛋白上樣Buffer將蛋白定量為5 mg/mL，-20℃保存?zhèn)溆?；將樣品加至制備好的SDS-PAGE電泳凝膠孔中，電泳儀設置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調至80 V使樣品通過濃縮膠與分離膠（電壓約8 V/cm）；電泳使染料至分離膠適當位置，結束電泳；凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至PVDF膜。恒壓狀態(tài)下，65 V轉膜2 h；將轉好的膜（參考目的條帶分子量大?。φ誱arker進行裁剪。小心取出轉移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下乳清蛋白封閉1 h，將封閉后的膜分別加入對應的一抗工作液中，4℃反應過夜，羊抗兔二抗孵育60 min，洗去游離二抗，使用ELC化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.5.5 熒光定量 RT-PCR法檢測CTGF、TGF-β1、BMP-7 mRNA轉錄水平 腎臟組織勻漿后，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用索萊寶反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成cDNA。采用實時熒光定量PCR儀，以20 μL反應體系上樣進行PCR反應，以β-actin為內參；反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性 10 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s，1循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21．0統(tǒng)計軟件進行數據分析，所有結果以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乾坤丹Ⅵ號對DN模型大鼠腎臟病理的改善作用 HE染色結果顯示，空白組大鼠腎小球飽滿，腎小管上皮細胞排列規(guī)則，腎小管結構正常；模型組大鼠腎臟腎小球萎縮、變形，腎小管細胞出現(xiàn)空泡變性；乾坤丹Ⅵ號組與陽性對照組腎臟結構有所好轉，損傷減輕。見圖1。

圖1 各組腎臟病理HE染色結果Fig.1 HE staining results of renal pathology in each group

2.2 乾坤丹Ⅵ號對DN模型大鼠血糖和血清微量白蛋白的調控作用 造模12周后，與空白對照組相比，模型組、乾坤丹Ⅵ號組和陽性對照組的血糖、尿微量白蛋白顯著升高（P＜0．01），且顯著高于閾值（隨機血糖≥16．7 mmol/L，24 h 尿蛋白定量≥30 mg），提示造模成功。乾坤丹Ⅵ號組與陽性對照組大鼠血糖、尿微量白蛋白顯著低于模型組（P＜0．01），且低于閾值。乾坤丹Ⅵ號組與陽性對照組間血糖、尿微量白蛋白無統(tǒng)計學差異（P＞0．01）。見表1。

表1 各組大鼠血糖和血清白蛋白檢測結果比較（±s）Tab.1 Comparison of blood glucose and serum micral bumin of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血糖和血清白蛋白檢測結果比較（±s）Tab.1 Comparison of blood glucose and serum micral bumin of rats in each group（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．01。

組別 動物數 血糖（mmol/L） 尿微量白蛋白（mg/L）空白對照組 10 5．470±0．776 13．470±1．642模型組 10 22．940±1．506* 72．980±4．587*乾坤丹Ⅵ號組 10 15．330±1．979*# 45．620±10．594*#陽性對照組 10 23．400±1．740* 49．290±6．719*#

2.3 乾坤丹Ⅵ號對糖尿病模型大鼠腎臟組織CTGF、TGF-β1、BMP-7蛋白表達水平的影響 Western blot檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組、乾坤丹Ⅵ號組和陽性對照組的CTGF、TGF-β1蛋白表達量顯著升高，而 BMP-7 蛋白表達顯著下調（P＜0．01），藥物治療后，乾坤丹Ⅵ號組和陽性對照組CTGF、TGF-β1蛋白表達量較模型組顯著降低，BMP-7蛋白表達量較模型組顯著升高（P＜0．01），且乾坤丹Ⅵ號組CTGF、TGF-β1蛋白表達量較陽性對照組顯著降低，BMP-7蛋白表達量較陽性對照組顯著升高（P＜0．01）。見圖2 和表2。

圖2 各組Western blot實驗結果Fig.2 Western blot experimental results in each group

表2 各組 BMP-7、CTGF、TGF-β1 蛋白相對表達量（±s）Tab.2 BMP-7，CTGF and TGF-β1 protein relative expression in each group（±s）

表2 各組 BMP-7、CTGF、TGF-β1 蛋白相對表達量（±s）Tab.2 BMP-7，CTGF and TGF-β1 protein relative expression in each group（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．01；與陽性對照組相比，△P＜0．01。

組別 動物數 BMP-7 CTGF TGF-β1空白對照組 10 0．458 8±0．005 6 0．316 9±0．010 8 0．164 2±0．000 3模型組 10 0．193 5±0．012 6* 0．762 4±0．016 0* 0．563 6±0．022 8*乾坤丹Ⅵ號組 10 0．393 5±0．007 4*#△ 0．508 4±0．001 4*#△ 0．303 6±0．025 3*#△陽性對照組 10 0．287 6±0．010 7*# 0．635 0±0．000 9*# 0．437 9±0．019 7*#

2.4 乾坤丹Ⅵ號對糖尿病模型大鼠腎臟組織CTGF、TGF-β1、BMP-7mRNA轉錄水平的影響 Real timePCR實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型組、乾坤丹Ⅵ號組和陽性對照組的CTGF、TGF-β1mRNA轉錄水平顯著升高，而BMP-7mRNA轉錄水平顯著下調（P＜0．01）；藥物治療后，乾坤丹Ⅵ號組和陽性對照組CTGF、TGF-β1 mRNA轉錄水平較模型組顯著降低，BMP-7mRNA 轉錄水平較模型組顯著升高（P＜0．01），且乾坤丹Ⅵ號組CTGF、TGF-β1mRNA轉錄水平較陽性對照組顯著降低，BMP-7mRNA轉錄水平較陽性對照組顯著升高（P＜0．01）。見表3。

表3 各組 BMP-7、CTGF、TGF-β1 mRNA 轉錄水平（±s）Tab.3 BMP-7，CTGF and TGF-β1 mRNA transcription level in each group（±s）

表3 各組 BMP-7、CTGF、TGF-β1 mRNA 轉錄水平（±s）Tab.3 BMP-7，CTGF and TGF-β1 mRNA transcription level in each group（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．01；與陽性對照組相比，△P＜0．01。

組別 動物數 BMP-7 CTGF TGF-β1空白對照組 10 1．035 2±0．032 6 1．005 4±0．008 8 1．027 8±0．033 5模型組 10 0．627 4±0．036 8* 4．360 8±0．249 8* 2．495 1±0．219 1*乾坤丹Ⅵ號組 10 0．826 5±0．009 7*#△ 1．457 6±0．040 9*#△ 1．490 7±0．021 9*#△陽性對照組 10 0．711 5±0．009 3*# 2．392 0±0．080 6*# 2．040 2±0．076 7*#

3 討論

DN早期沒有腎臟病方面的癥狀，甚至尿常規(guī)檢查也正常，極易漏診。一旦出現(xiàn)明顯的蛋白尿，腎臟的病理損傷已很難逆轉。目前對DN的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)足細胞的分化蛋白減少是導致DN持續(xù)發(fā)展的重要原因[3]。BMP-7是轉化生長因子-β超家族成員，在腎臟發(fā)育中起重要作用。BMP-7可部分逆轉糖尿病引起的腎臟肥大，恢復腎小球濾過率，使尿白蛋白排泄、腎小球組織學趨于正常。CTGF在腎小管間質損害過程中起重要作用，通過多種途徑誘導腎間質纖維化形成和發(fā)展，在腎間質纖維化中起重要作用[4]。研究表明，在DN模型腎組織中，CTGF上調，BMP-7下調；CTGF抑制了BMP-7的表達，且CTGF是治療DN的重要靶點之一[5]。TGF-β是一種具有多重生物學效應的細胞因子，參與了多種組織器官纖維化的形成[6]。TGF-β是CTGF的強效誘導物，CTGF是TGF-β的重要下游介質[7-8]。CTGF與TGF-β在腎小球病理改變中起到重要作用[9]。

目前常見的DN動物模型包括自發(fā)型、誘發(fā)型和轉基因動物模型。誘發(fā)型2型DN動物模型主要模擬人類2型DN發(fā)生發(fā)展的過程，其原理為采用高脂、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠1個月左右使大鼠產生胰島素抵抗，腹腔或尾靜脈注射STZ破壞大鼠胰島細胞，使其部分喪失分泌胰島素功能而模擬2型糖尿病的發(fā)生，在糖尿病模型成模后繼續(xù)喂養(yǎng)4～8周，可出現(xiàn)DN早期特征，且成模率與存活率均>90%[10]。

近年來，中醫(yī)藥治療DN表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。呂娟等[11]研究表明，當歸黃芪湯可抑制糖尿病大鼠JAK2STAT3信號通路的表達，而該信號通路與氧化應激損傷有關。鄧文超等[3]研究表明，黃芪水煎劑對DN大鼠腎間質Wnt/β-catenin及TGF-β1的表達也表現(xiàn)出抑制作用。宋恩峰等[12]研究了黃芪對DN大鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)黃芪可治療DN，其機制可能與降低腎組織CTGF蛋白及其mRNA的過度表達有關。因此，影響 TGF-β1、CTGF、BMP-7 信號通路可能是黃芪等中藥治療DN的作用機制之一。

乾坤丹Ⅵ號是本院醫(yī)生根據治療DN多年臨床經驗研制的院內制劑。主要由黃芪、天花粉、白茅根、蒲公英、麥冬、玄參等27味藥組成。功用健脾化濕行水，固腎養(yǎng)血祛痰；用于脾腎兩虛，陰虛火旺型糖尿病并發(fā)腎病或單純尿糖不消者。前期研究表明，乾坤丹Ⅵ號能顯著降低DN患者的尿蛋白、血糖、膽固醇、三酰甘油等指標的含量；與西藥對比，對DN患者有明顯的作用優(yōu)勢，能夠顯著延緩DN的發(fā)展。臨床研究表明，與陽性對照組相比，乾坤丹Ⅵ號治療組治療后兩組患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白、膽固醇、三酰甘油、血漿總蛋白的水平間差別均無統(tǒng)計學意義；而24 h尿白蛋白、24 h尿總蛋白含量間差別有統(tǒng)計學意義。說明乾坤丹Ⅵ號對延緩、阻止早、中期DN發(fā)展有一定療效。對耳穴敷貼聯(lián)合乾坤丹Ⅵ號治療氣陰兩虛型早期DN的臨床療效觀察也表明，耳穴貼壓聯(lián)合乾坤丹Ⅵ號治療早期DN（氣陰兩虛型）臨床療效確切、值得臨床上推廣使用[13]。

本研究中，乾坤丹Ⅵ號可顯著降低DN模型大鼠血糖，降低血清總蛋白含量，對于DN有一定治療作用。病理檢測結果顯示，乾坤丹Ⅵ號治療組大鼠的腎臟病變有所改善，腎小球萎縮與腎小管纖維化受到抑制。且通過Western blot和PCR檢測，結果顯示，乾坤丹Ⅵ號可顯著升高腎臟組織中BMP-7的轉錄與表達水平，降低CTGF和TGF-β1轉錄與表達水平。由于BMP-7對腎損傷有逆轉作用，可抑制腎小球損傷。BMP-7水平的升高，提示乾坤丹Ⅵ號對腎臟有一定保護作用。BMP-7的拮抗因子CTGF與TGF-β1在腎小球病理改變中起到重要作用，TGF-β/CTGF是引發(fā)腎臟纖維化、腎小球損傷的重要因子。乾坤丹Ⅵ號對這兩者的抑制作用，可能也是其治療糖尿病腎損傷，改善腎小球病理改變的主要機制。本研究結果表明，乾坤丹Ⅵ號發(fā)揮對DN的治療作用可能是通過影響TGF-β1-CTGF-BMP-7軸而發(fā)揮作用的。