馬中嶺，劉鑫，汪玉鳳

（青海省人民醫(yī)院產(chǎn)科，西寧 810007）

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種臨床常見的婦科疾病，因子宮內(nèi)膜組織發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲，定植在宮腔以外部位造成，患者常有痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)不調(diào)、盆腔包塊等癥狀，該病發(fā)病率高，影響著全球范圍內(nèi)5%～10%的育齡婦女，嚴(yán)重威脅著女性身體健康和生活質(zhì)量[1-2]。目前，西醫(yī)學(xué)臨床治療主要采用藥物和手術(shù)兩種療法，長期藥物療法可能加重肝腎功能損傷，而手術(shù)切除病灶后仍具有一定的復(fù)發(fā)率，臨床療效欠佳[3]。中醫(yī)認(rèn)為，腎虛血瘀、腎陽不足、瘀毒阻絡(luò)是誘發(fā)EMS的主要原因，因此，對于EMS的治療，應(yīng)以補(bǔ)腎活血、祛瘀解毒法為主，研究表明，補(bǔ)腎活血方（BSHXR）聯(lián)合西藥對EMS術(shù)后的療效確切，可提高治療效果，改善患者生活質(zhì)量，顯著減輕患者的臨床癥狀，降低EMS的復(fù)發(fā)率，然而BSHXR對EMS的治療作用機(jī)制尚不清楚[4-5]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/核因子 κB（NF-κB）途徑是一種密切參與到細(xì)胞生長繁殖、運(yùn)動、代謝和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的信號通路，多在惡性腫瘤疾病中呈激活狀態(tài)[6-7]。研究表明，EMS雖是良性婦科疾病，但其特點(diǎn)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲能力相似，同樣，PI3K途徑也與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病密切相關(guān)，該途徑的激活可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，加速EMS的發(fā)展進(jìn)程[8]。因此，本研究以PI3K/Akt/NF-κB途徑為切入點(diǎn)，研究BSHXR對EMS大鼠的治療作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠60只，健康未孕雌性，體質(zhì)量（250±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]。動物飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)動物房，飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，濕度 50%±10%，每日定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器 BSHXR由熟地黃6 g，楓香脂 10 g，人工麝香 10 g，蠐螬 10 g，土鱉蟲 10 g，五靈脂 6 g，制何草烏 6 g，乳香 10 g，虻蟲 10 g，當(dāng)歸 6 g組成，由本院藥劑科制備成含生藥量2 g/mL的水煎液；PI3K抑制劑LY294002（英國Abcam公司，貨號：ab120243）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R0896c）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（美國 Thermo scientific 公司，貨號：K1621、K0252）；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、核因子 κB（NF-κB）p65 兔單抗（美國CST 公司，貨號：77699、17366、17366、4685、4060、8242）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）（IgG-HRP）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：A0208）；雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24KS）；顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：IX53）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene，型號：G：BOX）；7500型PCR儀（美國AppliedBiosystems公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，型號：Multiskan MK3）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模方法 參考文獻(xiàn)方法建立EMS大鼠模型[9]：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉，固定、備皮、消毒，在下腹正中處打開腹腔，分離子宮，剪取右側(cè)子宮角的部分組織并剝離子宮內(nèi)膜，用活檢穿孔器取2個面積為5 mm×5 mm的片段，移植于腸系膜動脈血管處，盡量遠(yuǎn)離切口。使用慶大霉素沖洗腹腔，逐層關(guān)腹，縫合切口。術(shù)后3 d內(nèi)，大鼠腹腔注射0.1 mL慶大霉素防止感染。造模4周后，開腹觀察大鼠移植物呈橢圓形或圓形的囊性結(jié)節(jié)，高度≥2 mm，并且表面有大量血管形成，與周圍組織黏連緊密，表明造模成功，共成功造模50只大鼠。

1.3.2 分組與給藥 將建模成功的EMS大鼠隨機(jī)分為模型組、BSHXR高、中、低劑量組、LY294002組，每組10只，另取10只大鼠作為假手術(shù)組，僅開腹剪開子宮組織，隨后縫合。造模4周后開始給藥，按照人與大鼠體表面積折算等效劑量，中劑量為7.56 g/kg，高劑量為 15.12 g/kg，低劑量為 3.78 g/kg，BSHXR低、中、高劑量組大鼠按照上述劑量灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，LY294002組大鼠腹腔注射0.04g/kg的LY294002溶液，每日1次，連續(xù)28 d。

1.3.3 EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜病灶體積檢測 末次給藥后24 h，使用游標(biāo)卡尺測量各組大鼠異位子宮內(nèi)膜病灶的體積。處死大鼠后，腹主動脈取血，置于4℃冰箱中靜置3 h，然后3 000 r/min，離心15 min（離心半徑為12.5 cm），取上清液，用于ELISA試劑盒檢測。剝離大鼠子宮，假手術(shù)組分離正常子宮內(nèi)膜組織，其余各組大鼠分離異位子宮內(nèi)膜組織，生理鹽水清洗后取1 g用于實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）及Western blot檢測，其余組織放置于4%多聚甲醛溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）和免疫組化染色。

1.3.4 HE染色觀察異位子宮內(nèi)膜灶組織病理變化 將大鼠子宮內(nèi)膜組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4 μm組織切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇及蒸餾水中復(fù)水，HE染色，脫水、透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠異位子宮內(nèi)膜組織病理變化。

1.3.5 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 取各組大鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測 TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.6 免疫組化檢測異位子宮內(nèi)膜組織CD31表達(dá)取1.3.3中制備的組織石蠟切片，組織切片首先進(jìn)行烤片、脫蠟、復(fù)水，然后抗原修復(fù)、封閉，滴加稀釋的CD31兔單抗（稀釋比例為1∶100），放入濕盒中4℃過夜，次日滴加羊抗兔二抗37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后滴加DAB顯色液，蘇木精染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，每組切片于光鏡下拍攝5個視野，通過Image J軟件統(tǒng)計獲得CD31陽性細(xì)胞比率并取平均值，LSD-t檢驗(yàn)分析不同組間CD31陽性表達(dá)差異。

1.3.7 RT-qPCR檢測異位子宮內(nèi)膜組織VEGF及MMP-9 mRNA水平 取大鼠異位子宮內(nèi)膜組織，加入Trizol裂解液提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA作為熒光定量模版。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.8 Western blot法檢測異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平 取大鼠異位子宮內(nèi)膜組織，研磨勻漿后加入裂解液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，蛋白中加入loading buffer，混勻后置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性，然后進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜放入各一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像儀顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白對應(yīng)的灰度值，計算蛋白的相對表達(dá)量，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜病灶體積的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠無異位的子宮內(nèi)膜組織，模型組可見明顯異位子宮內(nèi)膜病灶形成。與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組大鼠及LY294002組大鼠異位子宮內(nèi)膜病灶體積均減小，其中，BSHXR降低異位子宮內(nèi)膜病灶體積的作用呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組與LY294002組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜體積的影響Fig.1 Effect of BSHXR on the volume of ectopic endometrium in EMS rats

2.2 EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)觀察 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜組織完整，上皮細(xì)胞排列整齊、有序，細(xì)胞核較小，腺體數(shù)量和形態(tài)正常。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞密集，細(xì)胞核較大，胞漿豐富，腺腔完整。與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組及LY294002組腺上皮細(xì)胞胞核體積縮小、不規(guī)則，排列松散，形態(tài)逐漸變?yōu)閱螌又鶢?，?nèi)膜腺上皮層變薄。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化（HE×400）Fig.2 The histopathological changes of endometrium of rats in each group(HE staining×400)

2.3 BSHXR 對 EMS大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 結(jié)果顯示，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平顯著高于假手術(shù)組，BSHXR低、中、高劑量組大鼠及LY294002組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平均低于模型組，BSHXR各劑量組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平與 LY294002組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較Fig.3 Comparison of serum inflammatory factors of rats in each group

2.4 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織CD31表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中CD31陽性細(xì)胞比例顯著增加，與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組CD31陽性細(xì)胞比例呈劑量依賴性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組CD31陽性細(xì)胞比例與LY294002組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織CD31表達(dá)水平比較（IHC，×400）Fig.4 Comparison of CD31 expression in ectopic endometrium of rats in each group(IHC，×400)

2.5 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平的影響 結(jié)果顯示，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平顯著高于假手術(shù)組，BSHXR低、中、高劑量組VEGF、MMP-9 mRNA水平低于模型組，BSHXR各劑量組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組VEGF、MMP-9 mRNA水平與LY294002組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平比較Fig.5 Comparison of VEGF and MMP-9 mRNA levels in ectopic endometrium of rats in each group

2.6 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PI3K、Akt磷酸化水平顯著增加，胞核中NF-κB p65表達(dá)增加，胞質(zhì)中NF-κB p65表達(dá)減少（P＜0.05）。與模型組比較，BSHXR 低、中、高劑量組及LY294002組PI3K、Akt磷酸化水平降低，胞核中NF-κB p65表達(dá)降低，胞質(zhì)中NF-κB p65表達(dá)增加，且BSHXR的作用呈劑量依賴性（P＜0.05）。BSHXR高劑量組PI3K、Akt磷酸化水平和NF-κB p65表達(dá)與LY294002組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of PI3K/Akt/NF-κB pathway protein expression levels in ectopic endometrial tissues of rats in each group

3 討論

EMS屬于臨床常見的良性婦科疾病，生育期女性的發(fā)病率較高，該病癥狀易反復(fù)且頑固，包括痛經(jīng)、性交疼痛、月經(jīng)異常、不孕等，發(fā)病易累及盆腔器官甚至全身組織，不僅損害患者個人身體健康，給患者家庭及中國衛(wèi)生系統(tǒng)也帶來較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10-11]。EMS 屬中醫(yī)“癥瘕”“不孕”“月經(jīng)不調(diào)”等范疇，血瘀和腎虛分別是EMS的關(guān)鍵病機(jī)和根本病機(jī)，血瘀和腎虛互為因果，相互影響，共同促進(jìn)EMS的發(fā)生和發(fā)展[5]。已有多項(xiàng)研究表明，以補(bǔ)腎活血法治療EMS可顯著改善患者月經(jīng)異常、經(jīng)期腹痛等癥狀，降低雌激素水平，提高患者生活質(zhì)量，但其具體作用機(jī)制尚不清楚[12-13]。本研究所用BSHXR由熟地黃、楓香脂、當(dāng)歸、制草烏、人工麝香、土鱉蟲、蠐螬、五靈脂、虻蟲、乳香等藥材組成，具有溫通補(bǔ)腎、活血化瘀之功效。本研究旨在通過EMS模型大鼠觀察BSHXR對EMS的治療作用，探究其作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠可見明顯異位子宮內(nèi)膜組織，病理切片顯示該組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞排列相對整齊，細(xì)胞核增大，腺腔完整，表明造模成功。使用高、中、低劑量BSHXR治療后，大鼠異位子宮內(nèi)膜病灶體積均降低，且大鼠異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閱螌又鶢?，腺體數(shù)量和基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少，表明BSHXR對EMS具有治療作用，與既往研究結(jié)果一致[14]。研究表明，EMS的發(fā)生與腹腔免疫監(jiān)視功能降低和炎癥反應(yīng)增加密切相關(guān)，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)能夠抑制異位子宮內(nèi)膜病灶的生長[15]。TNF-α、IL-1β、IL-6 均是參與機(jī)體免疫應(yīng)答、具有廣泛免疫調(diào)節(jié)的促炎細(xì)胞因子，具有促進(jìn)異位內(nèi)膜及間質(zhì)細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)血管生成的作用，可導(dǎo)致盆腔局部組織黏連及纖維化，促使EMS異位子宮內(nèi)膜病灶的形成[16-17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，使用不同劑量BSHXR治療后，大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低，表明BSHXR可減輕EMS大鼠炎癥反應(yīng)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，EMS的發(fā)生發(fā)展均涉及細(xì)胞的黏附、侵襲和血管形成過程，因此，抑制細(xì)胞異常的黏附、侵襲和血管形成過程已成為預(yù)防EMS的關(guān)鍵[18]。MMPs和VEGF是異位子宮內(nèi)膜在盆腔病變的關(guān)鍵因子，其中，MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中活性最強(qiáng)的一員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)EMS的侵襲和血管形成過程，而EMS患者M(jìn)MP-9基因的表達(dá)水平也往往呈異常增高的狀態(tài)，該基因的水平可作為評估EMS嚴(yán)重程度的指標(biāo)[19]。VEGF是一種強(qiáng)效特異性血管生成因子，可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)血管新生，加快在位子宮內(nèi)膜異常轉(zhuǎn)移及異位子宮內(nèi)膜的增生[20]。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，常用于反映血管生成情況[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織CD31陽性細(xì)胞比例升高，VEGF、MMP-9 mRNA水平亦顯著升高，使用BSHXR低、中、高劑量治療后，大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中CD31陽性細(xì)胞比例和VEGF、MMP-9 mRNA水平均降低，表明BSHXR治療EMS的機(jī)制之一可能是抑制CD31、VEGF及MMP-9的表達(dá)，抑制EMS黏附、侵襲和血管形成過程。

PI3K/Akt/NF-κB信號通路是一種密切參與到細(xì)胞生長繁殖、運(yùn)動、代謝和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的信號通路，幾乎所有人類和動物腫瘤疾病中均發(fā)現(xiàn)了其被活化的現(xiàn)象[22]。PI3K是生長因子受體超家族信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，可被生長因子、細(xì)胞因子和激素與受體酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而激活，激活后的PI3K可進(jìn)一步活化下游的Akt，而PI3K/Akt通路的表達(dá)改變會影響IκB的表達(dá)水平，由于IκB是NF-κB的抑制性因子，因此當(dāng)IκB被抑制后可促進(jìn)NF-κB的活化，并進(jìn)一步引起炎癥因子釋放[23-24]。研究表明，PI3K相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在EMS中發(fā)揮重要作用，抑制該信號通路的活化可改善大鼠EMS相關(guān)癥狀[25]。在本研究中，模型組大鼠PI3K、Akt磷酸化水平顯著增加，NF-κB p65轉(zhuǎn)移入核水平增加，使用BSHXR低、中、高劑量治療后，大鼠異位子宮內(nèi)膜中PI3K、Akt磷酸化水平降低，NF-κBp65入核減少。為了進(jìn)一步探究BSHXR治療EMS的作用機(jī)制，本研究同時使用了PI3K抑制劑LY294002。LY294002是PI3K的選擇性抑制劑，可阻斷該通路上部分基因和蛋白表達(dá)，有研究表明，LY294002可通過抑制PI3K通路對EMS動物產(chǎn)生治療作用，抑制上皮間質(zhì)細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26-27]。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，LY294002對EMS大鼠的治療作用與BSHXR高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示BSHXR對EMS的治療作用可能是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路活化產(chǎn)生的。

綜上所述，BSHXR可抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的活化，縮小異位子宮內(nèi)膜病灶體積，改善異位子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化，抑制炎癥反應(yīng)及血管新生過程，下調(diào)VEGF和MMP-9的表達(dá)。本研究初步揭示了BSHXR治療EMS的作用機(jī)制，但EMS是一種多因素疾病，病機(jī)復(fù)雜，其療效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)及臨床研究加以闡明。