劉燕珺，王 瓊*，沈易霖，隆旭紅，卓玉鳳，胡永清，徐 虎

（1.嘉峪關(guān)市食品藥品和醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 嘉峪關(guān) 735100；2.甘肅祁牧乳業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 嘉峪關(guān) 735100）

巴氏殺菌乳是最大限度保留生牛乳中優(yōu)質(zhì)蛋白、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的乳制品，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾膬?yōu)質(zhì)乳品，但是高溫加熱和過(guò)度加工會(huì)造成牛乳中活性成分和重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。熱加工可以有效殺滅生牛乳中的各種致病微生物，但也會(huì)對(duì)牛乳中的營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生影響[1-2]。熱處理強(qiáng)度不夠，牛乳中致病性微生物無(wú)法被殺滅。因此，使巴氏殺菌乳既能最大限度保留生牛乳中的優(yōu)質(zhì)蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又能有效殺滅牛乳中致病性微生物，巴氏殺菌乳的熱處理工藝至關(guān)重要。

本研究對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微生物的量進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并對(duì)熱敏指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，得出巴氏殺菌乳最佳熱處理工藝。

1 材料與方法

1.1 樣品的制備

1.1.1 生鮮乳的采集 生鮮乳采集于甘肅祁牧乳業(yè)有限責(zé)任公司牧場(chǎng)。檢測(cè)指標(biāo)：脂肪4.04%，蛋白3.16%，非脂乳固體8.53%，抗生素陰性（-），黃曲霉毒素M1 陰性（-）。

1.1.2 生鮮乳的熱處理 將生鮮乳過(guò)濾均質(zhì)后用熱加工設(shè)備分別在70 ℃、72 ℃、74 ℃、76 ℃、78 ℃、80 ℃、82 ℃、85 ℃加熱15 s，樣品為生鮮乳和熱處理后的乳制品各6 份，每份樣品100 ml，用無(wú)菌袋分裝，立即4 ℃保存，24 h 內(nèi)檢測(cè)，該試驗(yàn)進(jìn)行9次，結(jié)果取平均值。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)，UV-6100），高效液相色譜儀（Agilent，1260 Infinity，美國(guó)），凱氏定氮儀（FOSS，丹麥），離心機(jī)（SIGMA，德國(guó)），多功能乳品分析儀（FOSS，F(xiàn)T1，丹麥）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（Iris，德國(guó)），β- 乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA，美國(guó)），乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司），β-D-半乳糖苷酶（酷爾化學(xué)），葡萄糖氧化酶（SIGMA，美國(guó)），過(guò)氧化氫酶（酷爾化學(xué)），己糖激酶（SIGMA，美國(guó)），葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（酷爾化學(xué)），磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（SIGMA，美國(guó)），5'- 腺苷三磷酸二鈉鹽（上海藍(lán)季生物），過(guò)氧化氫（天津凱信化學(xué)），碳酸氫鈉（天津凱信化學(xué)），硫酸鋅（天津凱信化學(xué)），亞鐵氰化鉀（天津大茂化學(xué)），磷酸氫二鈉（西安化學(xué)試劑廠(chǎng)），磷酸二氫鈉（上海中秦化學(xué)），鹽酸（天津大茂化學(xué)），乙酸銨（天津大茂化學(xué)），甲醇（色譜純）（山東禹王試劑），乙腈（色譜純）（山東禹王試劑），辛醇（山東禹王試劑），三乙醇胺鹽酸鹽（天津大茂化學(xué)），乙酸（天津大茂化學(xué)），三氟乙酸（天津大茂化學(xué)），氫氧化鈉（西安化學(xué)試劑廠(chǎng)），氯化鈉（上海中秦化學(xué)），平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋），煌綠乳糖膽鹽肉湯（北京陸橋），結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（北京陸橋）等常用試劑。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 乳果糖 牛乳在熱加工過(guò)程中，乳糖在酪蛋白游離氨基的催化下，堿基異構(gòu)而形成的一種雙糖。其化學(xué)名稱(chēng)為4-o-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，可作為評(píng)價(jià)牛奶熱處理效應(yīng)的指標(biāo)[3]。檢測(cè)方法參照NY/T 939-2016《巴氏殺菌乳和UHT 滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》。試樣經(jīng)β-D-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生半乳糖和果糖，通過(guò)酶法測(cè)定產(chǎn)生的果糖量計(jì)算乳果糖含量。

1.4.2 糠氨酸 牛乳在熱加工過(guò)程中，氨基酸、蛋白質(zhì)與乳糖通過(guò)美拉德反應(yīng)生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴(lài)氨酸，經(jīng)酸水解轉(zhuǎn)換成更穩(wěn)定的糠氨酸[4-6]。檢測(cè)方法參照NY/T 939-2016《巴氏殺菌乳和UHT 滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》。試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜在紫外（波長(zhǎng)280 nm）檢測(cè)器下進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

1.4.3 β- 乳球蛋白 檢測(cè)方法參照T/TDSTIA 007-2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測(cè)定 液相色譜法》。試樣溶液調(diào)節(jié)至pH 4.6，使酪蛋白和變性的乳清蛋白沉淀，而未變性的β-乳球蛋白仍保留在溶液中，離心后可以在高效液相色譜儀上，經(jīng)反向蛋白質(zhì)分離柱分離，利用紫外光檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.4.4 乳鐵蛋白 檢測(cè)方法參照T/TDSTIA 006-2019《奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定 液相色譜法》。試樣中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，肝素親和柱富集凈化，用液相色譜儀分析，經(jīng)反向蛋白質(zhì)分離柱分離，紫外光檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.4.5 菌落總數(shù) 檢測(cè)方法參照GB4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.4.6 大腸菌群 檢測(cè)方法參照GB4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007 進(jìn)行整理，用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)分析，圖表分析等。以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中熱敏指標(biāo)

2.1.1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中乳果糖的指標(biāo) 由表1 和圖1 可知，生鮮乳中乳果糖為4.0 mg/L，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后乳果糖為8.7 mg/L，78 ℃/15 s熱處理后乳果糖為9.8 mg/L，85 ℃/15 s 熱處理后乳果糖為11.6 mg/L。隨著熱處理溫度的升高，牛乳中乳果糖的含量逐漸增加。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中乳果糖的指標(biāo)

表1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中各項(xiàng)指標(biāo)

2.1.2 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中糠氨酸的指標(biāo) 由表1 和圖2 可知，生鮮乳中糠氨酸為7.5 mg/100 g蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后糠氨酸為8.5 mg/100 g 蛋白質(zhì)，80 ℃/15 s 熱處理后糠氨酸為10.6 mg/100 g 蛋白質(zhì)，85 ℃/15 s 熱處理后糠氨酸為10.7 mg/100 g 蛋白質(zhì)。在熱處理?xiàng)l件80～85 ℃/15 s 時(shí)糠氨酸一直為平穩(wěn)狀態(tài)，在熱處理?xiàng)l件70～85 ℃/15 s 時(shí)牛乳中糠氨酸的含量緩慢增加，增加幅度不大。

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中糠氨酸的指標(biāo)

2.2 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中乳蛋白的含量

2.2.1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中β- 乳球蛋白的含量 由表1 和圖3 可知，生鮮乳中β-乳球蛋白為3 727 mg/kg，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后β-乳球蛋白為3 509 mg/kg，78 ℃/15 s 熱處理后β-乳球蛋白為3 318 mg/kg，≥80 ℃/15 s 熱處理后β-乳球蛋白為3 109～3 121 mg/kg。

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中β- 乳球蛋白的含量

2.2.2 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中乳鐵蛋白的含量由表1 和圖4 可知，生鮮乳中乳鐵蛋白為108 mg/kg，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后乳鐵蛋白為52 mg/kg，生鮮乳中乳鐵蛋白顯著高于經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后牛乳中的乳鐵蛋白（p＜0.05），差異48%。85 ℃/15 s 熱處理后乳鐵蛋白為40 mg/kg，在熱處理?xiàng)l件70 ℃/15 s～85 ℃/15 s 時(shí)牛乳中乳鐵蛋白差異不顯著（p＞0.05）。結(jié)果均符合優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳熱敏感和生物活性物質(zhì)指標(biāo)要求[7]中規(guī)定乳鐵蛋白≥25 mg/kg。

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中乳鐵蛋白的含量

2.3 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中微生物指標(biāo)

2.3.1 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中菌落總數(shù)的指標(biāo)由表1 和圖5 可知，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后菌落總數(shù)為570 CFU/g，78 ℃/15 s 熱處理后菌落總數(shù)為80 CFU/g，殺菌效果好，符合GB19645-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》規(guī)定。

圖5 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中菌落總數(shù)的指標(biāo)

2.3.2 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中大腸菌群的指標(biāo)由表1 和圖6 可知，經(jīng)過(guò)70 ℃/15 s 熱處理后大腸菌群為3 CFU/g，78 ℃/15 s 熱處理后大腸菌群為0 CFU/g，殺菌效果好，符合GB 19645-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》規(guī)定。76 ℃/15 s 熱處理后大腸菌群為1 CFU/g，對(duì)大腸菌群的消殺不夠徹底。

圖6 不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中大腸菌群的指標(biāo)

3 討論

3.1 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)牛乳中熱敏指標(biāo)的影響

Ⅱ型熱敏指標(biāo)是生鮮乳中本身不存在或者含量很少、熱處理過(guò)程中產(chǎn)生或顯著增加的一類(lèi)物質(zhì)。乳果糖和糠氨酸是比較重要的2 種Ⅱ型熱敏指標(biāo)[8]。

乳果糖是美拉德反應(yīng)過(guò)程中乳糖的堿基異構(gòu)化反應(yīng)生成的雙糖[8]。在70～85 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下，牛乳中乳果糖逐漸增加，與熱處理溫度成正比。

糠氨酸是牛乳在熱處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)和核糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的一種含有糠醛基的氨基酸[8]。在70～85 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下，牛乳中糠氨酸緩慢增加。在文獻(xiàn)中優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳熱敏感和生物活性物質(zhì)指標(biāo)要求中規(guī)定糠氨酸≤10 mg/100 g 蛋白質(zhì)，78 ℃/15 s 熱處理后糠氨酸為9.4 mg/100 g 蛋白質(zhì)，80 ℃/15 s 熱處理后糠氨酸為10.6 mg/100 g 蛋白質(zhì)，≤78 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下糠氨酸含量符合該文獻(xiàn)要求。

3.2 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)牛乳中乳蛋白的影響

β-乳球蛋白和乳鐵蛋白是乳制品中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的優(yōu)質(zhì)乳蛋白。

β-乳球蛋白是乳清蛋白的一種，具有保健和抗菌作用[9-10]。在70～85 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下，牛乳中β- 乳球蛋白逐漸減少，與熱處理溫度成反比。結(jié)果均符合優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳熱敏感和生物活性物質(zhì)指標(biāo)要求中規(guī)定β- 乳球蛋白≥2 200 mg/kg。

乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合蛋白，具有抗菌、抗氧化、抗癌和抗炎等活性[9,11]。生鮮乳中乳鐵蛋白為108 mg/kg，經(jīng)70 ℃/15 s 熱處理后降為52 mg/kg，≥70 ℃/15 s 熱處理對(duì)乳鐵蛋白有較大影響。

3.3 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)牛乳中微生物指標(biāo)的影響

GB 19645-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》對(duì)巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)和大腸菌群都做了明確的規(guī)定，牛乳在78 ℃/15 s 熱處理后菌落總數(shù)為80 CFU/g，大腸菌群未檢出。

綜上所述，牛乳在78 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下熱敏指標(biāo)較低，乳蛋白含量較高，菌落總數(shù)較低，大腸菌群未檢出，均符合優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳熱敏感和生物活性物質(zhì)指標(biāo)要求，是一種比較合理的熱處理?xiàng)l件。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下牛乳中熱敏指標(biāo)、乳蛋白含量和微生物指標(biāo)的系統(tǒng)分析，最終確定牛乳在78 ℃/15 s 熱處理?xiàng)l件下熱敏指標(biāo)較低，乳蛋白含量較高，菌落總數(shù)較低，大腸菌群未檢出，均符合優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳熱敏感和生物活性物質(zhì)指標(biāo)要求，是一種比較合理的熱處理?xiàng)l件，為廣大乳品企業(yè)巴氏殺菌乳熱處理工藝提供參考。