楊緒巖

摘? 要：目的? 比較高敏化學(xué)發(fā)光法（HISCL）和臨床常用的梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）檢測血清梅毒螺旋體特異性抗體的符合率。方法? 選擇2018年11月～2019年12月山東省新泰市皮膚病防治所采集的1 123份臨床檢測的血清樣本為研究對象，對血清樣本分別采取HISCL、TPPA與重組抗原免疫印跡法（RIBA）3種方法進行梅毒螺旋體檢測，以RIBA為金標準，對2種檢測方法的結(jié)果進行符合性分析。結(jié)果? 在1 123份臨床檢測的血清樣本中，HISCL與TPPA檢測結(jié)果均為陽性的樣本為116份，均為陰性的樣本數(shù)為1 001份，該檢測結(jié)果與重組抗原免疫印跡法檢測結(jié)果一致，檢測結(jié)果不一致的樣本數(shù)為6份，該6份樣本中TPPA檢測法均為陽性，HISCL檢測法均為陰性，但在RIBA檢測結(jié)果中僅1份為陽性，5份為陰性;HISCL 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果一致有1 122份，符合性為99.91%，TPPA 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果1 118例，符合性為99.55%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論? HISCL與TPPA 2種檢測方法的檢測結(jié)果與重組抗原免疫印跡法均具有較高的符合性，但在實際操作過程中HISCL方法具有可以更好地實現(xiàn)自動化、樣本分析時間短、操作簡單便捷、結(jié)果可靠的特點，在大批量樣品檢測中具有一定的優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：高敏化學(xué)發(fā)光;梅毒螺旋體明膠凝集試驗;梅毒特異性抗體;結(jié)果符合性

中圖分類號：R446文獻標識碼：A文章編號：1009-8011（2022）-11-0-03

梅毒螺旋體是引起梅毒的主要病原體，具有傳染性，患者發(fā)生皮膚損害時的破損處、血液、乳汁、精液以及唾液中均有梅毒螺旋體存在，與梅毒患者的潰瘍處或皮膚破損處密切接觸，都有可能發(fā)生傳染，性傳播與血液傳播是主要的傳播途徑，而且梅毒螺旋體可以通過胎盤屏障引起母嬰傳播[1-3]。梅毒作為我國乙類傳染病中的一種，為保證醫(yī)護人員以及醫(yī)院醫(yī)療環(huán)境的安全，在手術(shù)、輸液等醫(yī)學(xué)操作前均需要進行梅毒篩查。在醫(yī)學(xué)檢驗過程中，檢測結(jié)果的可靠性與可操作性是臨床檢驗學(xué)科中對檢測方法的可應(yīng)用性評價的主要因素，目前臨床上常用的檢測方法為梅毒螺旋體明膠凝集試驗（treponema pallidum particle assay，TPPA），該方法具有較高的靈敏度與特異性，但是其檢測過程中步驟相對復(fù)雜、檢測時間長，對大批量樣本檢測時存在困難。在保證準確率的前提下，尋找新的檢測方法以提高檢測效率與可操作性是檢驗人員首要考慮的。在本研究中，通過對1 123份血清樣本同時進行TPPA與高敏化學(xué)發(fā)光法（high sensitivity chemical iuminescence method，HISCL）進行梅毒螺旋體檢測，并與金標準重組抗原免疫印跡法（rebinant immunoblot assay，RIBA）進行比較，探討2種方法的符合性與準確度，為HISCL的臨床應(yīng)用提供參考。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

選擇2018年11月～2019年12月山東省新泰市皮膚病防治所采集的1 123份臨床檢測的血清樣本為研究對象，其中男517例，女606例;年齡7～68歲，平均年齡（39.8±3.32）歲。本研究經(jīng)山東省新泰市皮膚病防治所倫理委員會批準后開展。所選的樣本對象對此次研究開展均知情同意。

1.2? 納入與排除標準

納入標準：①患者年齡≤70歲;②患者需要進行梅毒生化篩查;③臨床資料完整。

排除標準：①伴血液疾病者;②伴免疫性系統(tǒng)病癥者。

1.3? 儀器與試劑

HISCL：①HISCL-5 000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀[生產(chǎn)企業(yè)：希森美康株式會社，產(chǎn)地：日本，注冊證編號：國械注進20192221950，結(jié)構(gòu)及組成：該產(chǎn)品是由加樣模塊、反應(yīng)模塊、檢測模塊、數(shù)據(jù)處理模塊、溫控模塊、清洗模塊、氣動裝置、軟件（發(fā)布版本號：Ver.00-13）組成];②梅毒螺旋體抗體檢測試劑包（HISCL）（生產(chǎn)企業(yè)：奧森多臨床診斷（英國）有限責(zé)任公司Ortho Clinical Diagnostics，產(chǎn)地：日本，注冊證編號：國械注進20173401367，規(guī)格：100測試/包裝），③梅毒螺旋體抗體校準品HISCL Anti-TP Calibrator[生產(chǎn)企業(yè)：Japan Lyophilization Laboratory，產(chǎn)地：日本;注冊證編號：國械注進20183402426，結(jié)構(gòu)及組成：梅毒螺旋體陰性校準品（HISCL TP NC）、梅毒螺旋體陽性校準品（HISCL TP PC）]。

TPPA：梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒，方法為凝集法（生產(chǎn)企業(yè)：富士瑞必歐株式會社FUJIREBIO INC，注冊證編號：國械注進20173406813，結(jié)構(gòu)及組成：由溶解液、血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子、陽性對照血清組成，盒內(nèi)還包含滴管）。

RIBA：梅毒螺旋體IgG抗體檢測試劑盒（間接免疫熒光法）[生產(chǎn)企業(yè)：歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，注冊證編號：國械注進20163402984，結(jié)構(gòu)及組成：生物載片、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的二抗、陽性對照、陰性對照、磷酸鹽（PBS）、吐溫 20、FTA吸附劑、RF吸附劑，試劑盒中還包含封片介質(zhì)和蓋玻片]。

梅毒螺旋體抗體質(zhì)控品[生產(chǎn)企業(yè)：奧森多臨床診斷（英國）有限責(zé)任公司Ortho Clinical Diagnostics，注冊證號：國械注進20173401360，結(jié)構(gòu)及組成：VITROS梅毒TPA質(zhì)控品1和2（含有抗菌劑的人體血漿）]。749A67E7-4AF0-4AD6-94CB-60315305E7B6

1.4? 方法

血清樣本的制備：采患者空腹時靜脈血，自然凝固20 min后，以4 ℃、3 000 轉(zhuǎn)/min條件下離心20 min，取上清，待測。對全部血清樣本分別采取HISCL、TPPA與RIBA 3種方法進行梅毒螺旋體檢測，以RIBA為金標準，對2種檢測方法的結(jié)果進行符合性分析。以上樣品檢測均由2名熟悉檢測過程的檢驗人員（具有1年及以上同方法檢測經(jīng)驗）進行。

HISCL：以HISCL-5 000全自動免疫分析儀操作規(guī)程以及試劑包的使用說明書按照檢測程序進行操作，在檢測前對全自動免疫分析儀的儀器性能進行檢測，梅毒螺旋體抗體質(zhì)控品檢測后且其結(jié)果符合質(zhì)控要求后，方可進行樣本檢測，在檢測的同時，同時對梅毒螺旋體陰性校準品（HISCL TP NC）;梅毒螺旋體陽性校準品（HISCL TP PC）進行同步檢測，測定血清樣本的發(fā)光強度。結(jié)果判斷：以臨界值指數(shù)（cut-off Index，COI）為最終結(jié)果進行判定，陰性：COI<1.0，陽性：COI>1.0。

TPPA：按照梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（凝集法）說明書與TPPA法檢驗操作規(guī)程要求進行操作：在微量反應(yīng)板第1孔中加入血清稀釋液，采取微量滴管或移液槍每次吸取25 μL，共4次;在第2、3、4孔中加入25 μL;隨后采取微量滴管或移液槍加入樣品，第1孔加入25 μL，第2、3、4孔以2n的方式進行加入。并將25 μL致敏粒子加入第3孔中。將微量反應(yīng)板放在平板混合器上振蕩30 s（力度：內(nèi)容物不得濺出），蓋上蓋子后于15～30 ℃條件下水平靜置。2 h后，將反應(yīng)液用觀察鏡觀察或利用免疫稀釋判定裝置，記錄現(xiàn)象并進行結(jié)果判定。結(jié)果判定：第1種：粒子的聚集狀態(tài)為紐扣狀，外周邊緣均勻、平滑的圖形則為陰性（-）;第2種：粒子的聚集形狀外周邊緣均勻且平滑的圓形，其狀態(tài)為小環(huán)狀，則為不確定性（±）;第3種：粒子外周邊緣也不均勻且雜亂地凝集在周圍，環(huán)明顯變大，則為陽性（+）;第4種：產(chǎn)生均一的凝集，呈膜狀延展則為強陽性（++）。

當在該方法中出現(xiàn)陽性結(jié)果，則將樣品按照下述方法繼續(xù)進行試驗：在微量反應(yīng)板第1孔中加入血清稀釋液，采取微量滴管或移液槍每次吸取25 μL，共4次;在第2、3、4孔中加入25 μL;隨后采取微量滴管或移液槍加入樣品，第1孔加入25 μL，第2、3、4孔以2n的方式進行加入。并將25 μL未致敏粒子加入第3孔中，并將25 μL致敏粒子加入第4孔至最后一孔。將微量反應(yīng)板放在平板混合器上振蕩30s（力度：內(nèi)容物不得濺出），蓋上蓋子后于15～30℃條件下水平靜置。2 h后，將反應(yīng)液用觀察鏡觀察或利用免疫稀釋判定裝置，記錄現(xiàn)象并進行結(jié)果判定。在試驗過程中需要進行對照試驗。結(jié)果判定：陽性：最終稀釋倍數(shù)為1∶40的未致敏粒子的反應(yīng)圖像判定為（-），最終稀釋倍數(shù)1∶80以上致敏粒子的反應(yīng)圖像判定為（+）時，最終判定為陽性，并將最終顯示出反應(yīng)圖像為（+）時的最終稀釋倍數(shù)作為抗體效價;陰性：無論未致敏粒子呈現(xiàn)何種反應(yīng)圖像，只要最終稀釋倍數(shù)1∶80致敏粒子的反應(yīng)圖像顯示為（-）時，最終判定即為陰性。

RIBA：按照試劑盒說明書進行操作，結(jié)果與參比卡進行比較，印跡膜條上出現(xiàn)2條及以上相對分子質(zhì)量為 4.7×104、1.7×104和1.4×104 的特異性色帶時，結(jié)果判為陽性;結(jié)果為一條特異度條帶時，結(jié)果判為可疑;反之則為陰性;可疑結(jié)果需要進行后續(xù)臨床觀察與復(fù)測。

1.5? 評價標準

2種檢測結(jié)果符合性分析：統(tǒng)計HISCL與TPPA兩種檢測方法中陰性結(jié)果與陽性結(jié)果，并將檢驗結(jié)果與RIBA法檢測的結(jié)果進行分析，分析兩種方法與RIBA法檢測結(jié)果的符合性。計算公式：符合性=A/B×100%（A：各方法與RIBA檢測結(jié)果相同的樣本量;B：總樣本量）

1.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用[n（%）]描述，數(shù)據(jù)組間差異比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? HISCL與TPPA檢測結(jié)果分析

在1 123份臨床檢測的血清樣本中，RIBA檢測結(jié)果中，1 006份為陰性，117份為陽性;HISCL與TPPA 2種方法檢測結(jié)果均為陽性的樣本為116份，均為陰性的樣本數(shù)為1 001份，檢測結(jié)果不一致的樣本數(shù)為6份，該6份樣本中TPPA檢測法均為陽性，HISCL檢測法均為陰性。HISCL 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果一致有1 122份，符合性為99.91%（1 122/1 123），TPPA 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果1 118份，符合性為99.55%（1 118/1 123），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2? 3種檢測結(jié)果不一致樣本結(jié)果分析

將6例結(jié)果不一致的樣本的檢測結(jié)果進行分析。見表2。

3? 討論

研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，近年來，梅毒的發(fā)生率不斷呈遞增趨勢增加。根據(jù)全國性控制中心統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，梅毒的病例數(shù)于1994年開始增長幅度顯著。梅毒不僅危害著患者的身體健康，同時作為傳染病，可以通過血液等途徑進行傳播，如若未加控制，會引起公共衛(wèi)生問題，因此在進行手術(shù)、侵入性檢查、輸液等醫(yī)學(xué)手段實施前需要對患者進行梅毒篩查。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，目前應(yīng)用在臨床上針對梅毒檢測的方法有免疫印跡法、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、明膠凝集試驗、化學(xué)發(fā)光分析法等。本研究將RIBA作為金標準，分析對比HISCL與TPPA的檢測效果。將RIBA作為金標準其原因是，RIBA是以重組基因抗原轉(zhuǎn)印到載體上，檢測相應(yīng)抗體的酶免疫試驗方法，該方法與免疫印跡法具有相同之處，通過SDS-PAGE進行不同分子量的蛋白片段進行分離，不同之處是在于特異性抗原不通過電泳分離轉(zhuǎn)運，而是直接分條通過電轉(zhuǎn)移加在固相膜上，對其進行酶免疫定位，SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，避免了其他蛋白對反應(yīng)的干擾，RIBA的反應(yīng)原理主要是采取硝酸纖維素膜對各種不同的抗原成分進行吸附，在膜上以線條的形式顯現(xiàn)，將不同的抗原進行收集并與標本（一抗）和酶標二抗混合，在適宜的條件下進行溫育和洗滌，并與底物反應(yīng)，當樣本中存在具有針對吸附抗原的特異性抗體時，出現(xiàn)顯色反應(yīng)，通過對條帶的位置以及分子量大小判斷結(jié)果。明膠凝集試驗的實施，由于該方法容易出現(xiàn)假陰性、檢測過程復(fù)雜、實驗人員主觀參與度較高、耗時長、占用檢驗資源多等缺點，已逐漸被其他檢測方法替代[4-5]。分子發(fā)光光譜分析法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，其中高敏化學(xué)發(fā)光法是其中的一種[6]，在臨床上用于定性或者定量檢測人血清或血漿中的特定物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和多肽、感染癥、激素、腫瘤標記物、凝血分子等項目，具有廣泛的應(yīng)用。該產(chǎn)品基于化學(xué)發(fā)光酶免疫測定原理，與配套檢測試劑共同使用，待測物濃度與化學(xué)發(fā)光強度在一定檢測范圍內(nèi)呈線性關(guān)系[7]，儀器通過光學(xué)檢測對體系產(chǎn)生的光強度進行檢測并進行換算，從而得到待測物質(zhì)具體的含量或濃度，該方法具有高靈敏度、高特異性與寬線性范圍[8]。該方法使用的樣本量極少，所有項目僅需要10～30 μL，檢測時間短，僅需要15～17 min，一次性檢測樣本數(shù)量為100份，結(jié)果直觀，避免了人為判斷的誤差。使檢驗分析過程流程化、機械化，節(jié)省了醫(yī)療資源，提高了檢驗效率與檢驗結(jié)果的可靠性。749A67E7-4AF0-4AD6-94CB-60315305E7B6

在本研究中，在1 123份臨床檢測的血清樣本中，HISCL與TPPA 2種方法檢測結(jié)果均為陽性的樣本為116份，均為陰性的樣本數(shù)為1 001份，該檢測結(jié)果與重組抗原免疫印跡法檢測結(jié)果一致，檢測結(jié)果不一致的樣本數(shù)為6份，該6份樣本中TPPA檢測法均為陽性，HISCL檢測法均為陰性，但在RIBA檢測結(jié)果中僅1分為陽性，5份為陰性;HISCL 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果一致有1 122份，符合性為99.91%，TPPA 檢測結(jié)果與RIBA檢測結(jié)果1 118份，符合性為99.55%，差異無具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，HISCL與TPPA 2種檢測方法的檢測結(jié)果與均具有較高的符合性，但在實際操作過程中HISCL方法具有可以更好地實現(xiàn)自動化、樣本分析時間短、操作簡單便捷、結(jié)果可靠的特點，在大批量樣品檢測中具有一定的優(yōu)勢。

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