向潤　江龍

摘要：毛狀根良好的生長狀況是建立毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系的關鍵，為優(yōu)化毛狀根培養(yǎng)基成分，確定適宜毛狀根生長的蔗糖濃度，改善煙草毛狀根的生長狀況，該研究以發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1誘導2個煙草品種NC82和Va116葉片產(chǎn)生毛狀根，經(jīng)PCR檢測證實后，用含有不同蔗糖濃度的1/2MS培養(yǎng)基分別進行固體和液體優(yōu)化培養(yǎng)，通過測定毛狀根的分枝數(shù)、鮮重（FW）與干重（DW），研究蔗糖對2個品種煙草毛狀根生長的影響。結果表明：（1）C58C1均能誘導兩種煙草葉片產(chǎn)生毛狀根，但誘導率不同，NC82（87.3%）的誘導率更高，是Va116（38.6%）的2.26倍。（2）培養(yǎng)基蔗糖濃度顯著影響毛狀根生長，因煙草品種和起始分枝數(shù)而異。（3）固體培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)NC82和Va116的毛狀根，分枝數(shù)增長的抑制蔗糖濃度分別為25 g·L1和15 g·L1;液體培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)分別在25 g·L1和15 g·L1時F（D）W達到最大，分別為0.541 g（0.055 g）、0.474 g（0.050 g）。（4）綜合分枝數(shù)、F（D）W、毛狀根生長勢考慮，C58C1誘導NC82毛狀根最適培養(yǎng)基蔗糖濃度為25 g·L1，Va116毛狀根為15 g·L1。該文優(yōu)化了煙草毛狀根培養(yǎng)基組成的適宜蔗糖濃度及培養(yǎng)方法，為后續(xù)毛狀根大量擴繁奠定基礎，建立了毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系，解決了關鍵的寄主生長不良的問題。

關鍵詞： 毛狀根， 蔗糖， 培養(yǎng)基優(yōu)化， 分枝數(shù)， 鮮重， 干重

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2022）05080209

Effects of sucrose on growth of tobacco hairy roots

induced by Agrobacterium rhizogenes C58C1

Abstract：As the host， the hairy roots have good growth conditions， which is the key to establish the hairy rootAM fungus dual culture system. In order to optimize the medium composition， to screen the sucrose concentration suitable for the growth of hairy roots and to improve the growth of tobacco hairy roots， leaf growth of two types of tobacco， NC82 and Va116 were induced to have hairy roots through solid and liquid culture on 1/2MS medium with different sucrose concentrations and confirmed by PCR. The effects of sucrose on the growth of two tobacco hairy roots were studied by measuring the number of branches， fresh weight （FW） and dry weight （DW） of hairy roots. The results were as follows： （1）C58C1 could induce hairy roots in both tobacco leaves， but the induction rates were different. The induction rate of NC82 （87.3%） was higher， which was 2.26 times that of Va116 （38.6%）. （2） The number of hairy root branches induced by NC82 and Va116 increased with the incubation time， and the increased amount varied with the concentration of sucrose. Sucrose has a significant effect on the growth of hairy roots， depending on the tobacco variety and the number of initial branches. （3） The solid medium was optimized to cultivate the inducedNC82 and Va116 hairy roots， and the inhibitory sucrose concentrations for branch number growth were 25 g·L1 and 15 g·L1， respectively. In addition， the results of liquid optimized culture showed that the hairy roots induced by NC82 and Va116 reached the maximum F（D）W at 25 g·L1 and 15 g·L1， respectively， which were 0.541 g （0.055 g） and 0.474 g（0.050 g） respectively， which was mutually corroborated with solid optimized culture. （4） The present data suggested that the concentration of sucrose in the medium significantly affected the growth of hairy roots. Considering the number of branches， F（D）W， and hairy root growth vigor， C58C1 induced NC82 hairy roots with optimal sucrose concentration was 25 g·L1， and the hairy roots of Va116 was 15 g·L1. The study of tobacco hairy roots optimized the suitable sucrose concentration in the medium， laying a foundation for subsequent largescale propagation of hairy roots; at the same time， established a hairy rootAM fungus double culturing system and solved the problem of poor growth of hairy roots as a host.

Key words： hairy root， sucrose， optimization of medium， branch number， fresh weight， dry weight

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌能與地球上80%以上的陸生維管植物形成互惠共生體（夏庭君等，2018），可促進植物吸收土壤礦質(zhì)營養(yǎng)（江龍等，2010），提高植物抗逆性、抗病性（Augé et al.，2015;王丹丹等，2019），改善土壤結構（Rillig & Mummey，2010;Leifheit et al.，2014;），修復土壤重金屬污染等（Meier et al.，2015），既可作天然菌肥，又可作生防制劑，在農(nóng)（林）業(yè)生產(chǎn)中，具有廣闊的應用前景。但AM真菌是專性共生體，需與寄主植物共生，才能生長和完成生活史，所以AM真菌目前還不能純培養(yǎng)， 這使得AM真菌菌劑規(guī)?；a(chǎn)受到極大限制（Berruti et al.，2016）。以Ri TDNA轉(zhuǎn)型根（以下簡稱毛狀根）為寄主，接種AM真菌孢子，建立毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系，是解決AM真菌純培養(yǎng)和菌劑規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑（Jolicoeur et al.，1999）。冉海燕（2016）研究表明，毛狀根的生長狀況對AM真菌的侵染、生長發(fā)育和產(chǎn)孢均有顯著影響，是建立毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系的關鍵條件。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染植物葉片等外植體，其自身攜帶的Ri 質(zhì)粒上的TDNA片段在進入植物細胞后隨機整合，利用植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄和表達，可產(chǎn)生大量毛狀根（Kregtenmv et al.，2016）。毛狀根是利用轉(zhuǎn)基因技術實現(xiàn)的，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化篩選得到的單克隆體，具有很強的穩(wěn)定性。本項目前期研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1可誘導煙草葉片產(chǎn)生毛狀根，但毛狀根的生長狀況受到培養(yǎng)基組成、植物生長物質(zhì)、培養(yǎng)條件的影響（盧錫鋒，2020）。在毛狀根培養(yǎng)中，培養(yǎng)基常用的碳源有蔗糖、果糖和葡萄糖，毛狀根快速生長需要較多的碳原子數(shù)和較高的能量（李鳳華等，2004），葡萄糖和果糖的碳原子數(shù)和能量都不如蔗糖，蔗糖更易于被植物細胞感知，分解轉(zhuǎn)化獲得較高能量，有利于毛狀根生長（Gibson，2005）。建立煙草毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系的首要條件是要有良好的毛狀根培養(yǎng)體系，因為培養(yǎng)基中蔗糖濃度會直接影響煙草毛狀根生長。

本研究以發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1誘導2個煙草品種NC82和Va116葉片產(chǎn)生毛狀根，經(jīng)PCR檢測證實后，將毛狀根置于含有不同蔗糖濃度的1/2MS培養(yǎng)基中進行優(yōu)化培養(yǎng)，通過測定毛狀根的分枝數(shù)、鮮重和干重，旨在研究蔗糖濃度對2個品種煙草毛狀根生長的影響，從而確定煙草毛狀根優(yōu)化培養(yǎng)基組成的適宜蔗糖濃度及培養(yǎng)方法，以期為建立煙草毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系提供基礎條件，也為其他植物材料誘導毛狀根提供參考。

1材料與方法

1.1 實驗材料

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株：C58C1，由貴州大學生命科學學院生物化學實驗室提供。煙草品種：NC82、Va116，由貴州大學生命科學學院植物生理實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛狀根誘導煙草無菌苗的獲得：參考盧錫鋒（2020）的方法，用75%酒精和10%次氯酸鈉消毒獲得煙草無菌苗。

發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌種侵染液制備：參考盧錫鋒（2020）方法進行菌液活化，用MS液體培養(yǎng)基（含100 umol·L1乙酰丁香酮）懸浮，即侵染菌液。

誘導毛狀根：參考盧錫鋒（2020）的方法，將經(jīng)預培養(yǎng)2～3 d的煙草葉片（2 cm × 2 cm）放入懸浮菌液，侵染約8～10 min，置于MS培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g·L1），黑暗條件下共培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基（含500 mg·L1 頭孢霉素、100 mg·L1特美?。T導出毛狀根。挑選生長快、長勢旺盛且分枝多的毛狀根，用1/2MS培養(yǎng)基進行擴繁，25 ℃暗培養(yǎng)，供毛狀根優(yōu)化培養(yǎng)階段選用。

1.2.2 毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)及生長測定PCR檢測：參考胡霄等（2015）的方法，使用PCR對NC82和Va116兩種煙草葉片誘導產(chǎn)生的根進行檢測。

固體優(yōu)化培養(yǎng)：用1/2MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導得到的毛狀根，其中設置不同煙草品種（NC82和Va116）、起始分枝數(shù)（起始0分枝和1～2分枝）、蔗糖濃度（0、5、10、15、20、25、30、35、40 g·L1）3個因素，共36個處理，每個處理3組，每組3皿（培養(yǎng)皿直徑90 mm）。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8～6.0，培養(yǎng)時毛狀根于25 ℃暗培養(yǎng)，每2天統(tǒng)計不同起始分枝量毛狀根在不同處理的分枝數(shù)，累計20 d。

液體優(yōu)化培養(yǎng)：在固體優(yōu)化培養(yǎng)的基礎上，配制1/2MS液體培養(yǎng)基，其中蔗糖濃度分別為15、20、25、30 g·L1，4個處理，每個處理3個重復，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0，每150 mL錐形瓶裝入80 mL培養(yǎng)基，滅菌冷卻備用。在超凈臺中取活力較好的毛狀根置于含有不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基中，25 ℃避光懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110 r·min1。懸浮培養(yǎng)30 d后，迅速用濾紙擦干，測得鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），然后在102～105 ℃烘箱中殺青10 min，把烘箱溫度降低至70～80 ℃烘至恒重，冷卻至室溫測其質(zhì)量為干重（dry weight，DW）。

毛狀根誘導率（%）=（產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量）×100。

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS 22.0軟件進行分析。

2結果與分析

2.1 毛狀根誘導狀況及PCR鑒定結果

發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1可誘導NC82和Va116兩種煙草葉片產(chǎn)生毛狀根。用菌液將NC82和Va116兩種煙草葉片進行侵染，一周左右葉片傷口處出現(xiàn)毛狀根，12 d后C58C1對NC82和Va116的毛狀根誘導率分別為54.4%和20.5%，一周后（19 d）增加到87.3%和38.6%。誘導出的毛狀根分枝多，生長速度快，可在無激素培養(yǎng)基上正常生長（圖1）。

經(jīng)PCR檢測，NC82和Va116兩種煙草葉片誘導產(chǎn)生的根均為毛狀根。兩種煙草毛狀根的DNA經(jīng)PCR擴增后，均檢測出特異性擴增產(chǎn)物，通過與發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1陽性對照和DNA分子量標記（M）比較，可確定待測毛狀根中均含有rolB基因的片段（約741 bp）（圖2），結果表明發(fā)根農(nóng)桿菌中Ri質(zhì)粒的rolB基因已整合入NC82與Va116細胞基因組中，rolB基因表達使兩種煙草葉片長出毛狀根。

2.2 蔗糖濃度對毛狀根生長的影響

2.2.1 固體培養(yǎng)基不同蔗糖濃度對毛狀根分枝增長的影響結果表明，NC82和Va116誘導的毛狀根分枝數(shù)量隨培養(yǎng)時間而增加，增加量因蔗糖濃度而異（圖3，圖4）。蔗糖濃度為0和5 g·L1時，NC82和Va116起始0分枝和1～2分枝的毛狀根分枝增加量均為最低，在培養(yǎng)4 d后，分枝數(shù)增加到8條趨于停止;蔗糖濃度為10 g·L1時，除NC82起始1～2分枝的毛狀根在培養(yǎng)14 d后，分枝數(shù)增加到18條趨于停止，其余處理隨培養(yǎng)時間而增加。蔗糖濃度為15、20、25、30、35、40 g·L1時，各處理的毛狀根分枝數(shù)均隨培養(yǎng)時間而增加，培養(yǎng)20 d時，毛狀根分枝數(shù)均為最大，其中NC82起始0分枝，毛狀根分枝數(shù)分別達到18、27、26、23、13、15，起始1～2分枝，達到32、29、71、54、24、31。Va116起始0分枝，毛狀根分枝數(shù)達到29、12、25、8、8、16，起始1～2分枝，達到75、30、40、25、24、25。

蔗糖濃度顯著影響NC82和Va116誘導的毛狀根分枝數(shù)量，因煙草品種和起始分枝數(shù)而異（圖5，圖6）。在蔗糖濃度為0～40 g·L1范圍內(nèi)，各處理毛狀根分枝數(shù)量均呈現(xiàn)隨蔗糖濃度先增加后減少的變化規(guī)律，不同蔗糖處理存在其特有抑制濃度。NC82起始0分枝的毛狀根分枝數(shù)量在蔗糖濃度為0～20 g·L1時，隨濃度增加，毛狀根分枝數(shù)量增加，培養(yǎng)20 d時，達到27條分枝，20 g·L1為其抑制濃度，超過后，隨濃度增加毛狀根分枝數(shù)量減少;NC82起始1～2分枝的抑制濃度為25 g·L1。Va116起始0分枝的抑制濃度為15 g·L1，1～2分枝為15 g·L1。

所以，固體培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)中，NC82誘導的毛狀根適宜的蔗糖濃度為20～30 g·L1，Va116誘導的毛狀根為15～25 g·L1。

2.2.2 液體培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度對毛狀根重量的影響蔗糖濃度顯著影響NC82和Va116誘導的毛狀根生長量的積累和生長狀況，因煙草品種而異 （圖7，表1）。在蔗糖濃度15～30 g·L1范圍內(nèi)，NC82誘導的毛狀根FW和DW呈現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律，在蔗糖濃度為25 g·L1時FW和DW最高，分別為0.541 g和0.055 g。Va116誘導的毛狀根不同，在15 g·L1時FW和DW最高，分別為0.474 g和0.050 g，之后隨蔗糖濃度增加逐漸減少。培養(yǎng)30 d后，15 g·L1處理NC82和Va116誘導的毛狀根分枝較多，根體較細且褐化少;30 g·L1處理毛狀根分枝變少，且褐化明顯，褐化的毛狀根變粗、變硬，脆而易斷（圖7）。

綜合固體優(yōu)化培養(yǎng)毛狀根分枝數(shù)的增加和液體優(yōu)化培養(yǎng)毛狀根的F（D）W，可得出結論：發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1誘導煙草NC82和Va116毛狀根最適宜的培養(yǎng)基蔗糖濃度分別為25 g·L1和15 g·L1。

3討論與結論

AM真菌專性共生的特性限制了其在農(nóng)（林）業(yè)生產(chǎn)中的應用，以毛狀根為寄主，接種AM真菌孢子，建立毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系，是解決AM真菌純培養(yǎng)和菌劑規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。冉海燕（2016）前期研究表明，盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）可與發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導的煙草毛狀根建立了共生體系，并產(chǎn)生新孢子;幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）可與發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和A4誘導的煙草毛狀根建立共生體系（盧錫鋒，2020），實現(xiàn)了毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)。毛狀根生長狀況、培養(yǎng)基成分、外源物質(zhì)、pH、溫度等都會影響雙重培養(yǎng)體系中AM真菌孢子的生長（冉海燕，2016;盧錫鋒，2020）。

作為寄主的毛狀根的生長狀況，對AM真菌的連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義，毛狀根生長不良會限制AM真菌生長發(fā)育。影響毛狀根生長的因素（培養(yǎng)基、pH、光照、溫度等）中，培養(yǎng)基中的蔗糖為毛狀根的生長提供適宜的能量和能源，是影響毛狀根生長的決定性因素（劉高等，2007），是雙重培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基的關鍵組分（Bécard & Fortin，1988），蔗糖濃度對毛狀根的生長和孢子的發(fā)育均有顯著影響（Mohan et al.，2017）。

在離體組織培養(yǎng)過程中，碳源可作為底物為植物生長提供能量（Staikidou et al.，2005），并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液滲透壓（Neto & Otoni，2003）。蔗糖是最常用的碳源，是培養(yǎng)基組成成分中的關鍵因子（田翠婷等，2007），在植物體細胞組織培養(yǎng)中，蔗糖一直作為標準碳源（丁世萍等，1998），大多數(shù)合成培養(yǎng)基均以蔗糖作為唯一的碳源（劉冬云等，2005），但要注意使用濃度。呂芝香（1981）的觀點是，在植物組織培養(yǎng)中最適宜的蔗糖濃度為20～40 g·L1。也有研究證明，培養(yǎng)基中蔗糖為30 g·L1時石斛毛狀根（李鳳華等，2004）、三裂葉野葛毛狀根（何含杰等，2005）和金鐵鎖毛狀根（劉興斌等，2018）生長最快;使用組合碳源（20 g·L1蔗糖和30 g·L1葡萄糖）最有利于水母雪蓮毛狀根生長（楊睿等，2005）。在畢銀麗等（1999，2000）的研究中，用發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導胡蘿卜產(chǎn)生毛狀根與球狀巨孢囊霉（Gigaspora margarita）和根內(nèi)根孢囊霉 （Rhizophagus intraradices） 建立雙重培養(yǎng)體系

采用含蔗糖10 g·L1的M培養(yǎng)基;在趙長竹（2005）的研究中，發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導的檸檬毛狀根與Gigaspora margarita和摩西球囊霉（Glomus mosseae）建立雙重培養(yǎng)，110MS培養(yǎng)基含10 g·L1蔗糖毛狀根生長最好。邢曉科等（2003）建立地斗管囊霉（Funneliformis geosporum）與胡蘿卜毛狀根雙重培養(yǎng)體系和曹玲（2009）用發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導紫云英毛狀根與Gigaspora margarita和玫瑰紅巨孢囊霉（Gi. rosea）建立雙重培養(yǎng)體系，MSR培養(yǎng)基中蔗糖都是10 g·L1。Srinivasan等（2014）建立了胡蘿卜毛狀根與異形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）雙重培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)70 d后，產(chǎn)孢率更高，分析其原因可能與培養(yǎng)基中蔗糖含量降低有關，認為產(chǎn)孢率取決于培養(yǎng)基中的蔗糖濃度，不添加蔗糖的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量更多;D′Souza等（2013）在研究根孢囊霉孢子體外萌發(fā)時也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，無蔗糖更利于孢子萌發(fā)。Mohan等（2017）建立了胡蘿卜毛狀根與根孢囊霉雙重培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)10 g·L1蔗糖濃度最利于根系定殖，定殖率隨蔗糖濃度的增加而顯著降低，但是蔗糖濃度為20 g·L1和30 g·L1時新生孢子數(shù)大于10 g·L1。目前，在AM真菌純培養(yǎng)的研究中，誘導毛狀根的材料大多數(shù)選用胡蘿卜，也有選用檸檬（趙長竹，2005）、紫云英（曹玲，2009）、土豆（Puri & Adholeya，2013）等，而選用煙草的少見報道，且未有研究者探討過使用煙草誘導毛狀根與AM真菌孢子建立雙重培養(yǎng)體系時，培養(yǎng)基中適宜毛狀根生長的蔗糖濃度，我們后續(xù)將進一步完善煙草毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系，這就必須先建立生長狀況良好的毛狀根培養(yǎng)體系。

本研究結果表明，在30 g·L1蔗糖濃度下使用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1誘導葉片均可長出毛狀根，只是對兩種煙草的誘導率有所不同：對NC82（87.3%）的誘導率更高，是對Va116（38.6%）的2.26倍，這表明不同基因型材料會影響毛狀根的誘導，此結果與李錦錦等（2012）的研究相符。李潤田等（2020）的研究表明30 g·L1蔗糖濃度下西洋參不定根誘導率高于15 g·L1和40 g·L1，本研究結果表明30 g·L1的蔗糖濃度對于誘導煙草毛狀根同樣適用。NC82和Va116的毛狀根分枝數(shù)量隨培養(yǎng)時間而增加，增加量因蔗糖濃度而異;蔗糖濃度顯著影響NC82和Va116的毛狀根分枝數(shù)量，因煙草品種和起始分枝數(shù)而異，毛狀根分枝增長的抑制蔗糖濃度分別為25 g·L1和15 g·L1。蔗糖濃度對毛狀根F（D）W的影響因煙草品種而異，NC82的毛狀根在25 g·L1時F（D）W最高0.541 g（0.055 g）;而Va116的毛狀根在15 g·L1時最高，分別為0.474 g（0.050 g）。因此，綜合分枝數(shù)、F（D）W、毛狀根生長勢考慮，進一步確定了NC82的毛狀根最優(yōu)生長蔗糖濃度為25 g·L1，Va116的毛狀根最優(yōu)生長蔗糖濃度為15 g·L1。

良好的毛狀根培養(yǎng)體系是成功建立雙重培養(yǎng)體系的關鍵。本研究優(yōu)化了NC82和Va116兩種煙草毛狀根培養(yǎng)基組分配比，為毛狀根大量擴繁奠定基礎，為后期煙草毛狀根AM真菌雙重培養(yǎng)體系的建立奠定了良好的基礎，也為其他植物材料誘導毛狀根提供參考。

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（責任編輯李莉）

收稿日期：2021-02-09

基金項目：國家科技支撐計劃項目 （2015BAD04B0204）

第一作者： 向潤（1996-），碩士，研究方向為菌根生物學，（Email）2141700255@qq.com。

通信作者：江龍，博士，教授，研究方向為植物生理學、菌根生物學，（Email）ljiang@gzu.edu.cn。