畢敬豆， 穆怡含， 張鈺瑤， 李 靈 ， 鄧小寬， 高 平 ， 周鵬程 ， 蔣學(xué)瑛， 蔣小紅， 劉 競， 陳海瓊

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065；2.四川省通世達(dá)生物科技有限公司 資陽市院士(專家)工作站， 資陽 641500)

1 引 言

蠶沙(Faeces Bombycis)，我國傳統(tǒng)蟲類中藥，始載于《名醫(yī)別錄》，是蠶蛾科家蠶屬昆蟲家蠶(BombyxmoriLinnaeus)幼蟲的干燥糞便[1,2].蠶沙是桑蠶產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物之一，主產(chǎn)地有浙江、江蘇、四川等省份.《本草綱目》中記載[3]蠶沙具有祛風(fēng)除濕、和胃化濕、清熱明目、活血定痛的功效.現(xiàn)代藥理研究表明蠶沙中的活性成分包括黃酮類、生物堿類、萜類、香豆素類等[4]，其提取物具有促進(jìn)骨髓造血[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化、降低人體膽固醇含量[7]、降血糖[8]、抗炎[9]和鎮(zhèn)痛[10]等活性.臨床上蠶沙常作為治療糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用藥物[11]，研究證明其主要降糖成分為1-脫氧野尻霉素，效果顯著.因此，該中藥具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值.

蠶沙中富含葉綠素，是食品工業(yè)中天然著色劑的良好來源[12].20世紀(jì)六七十年代研究者便開始利用蠶沙提取葉綠素，相比較從高等植物中提取葉綠素，蠶沙資源豐富，其中含量高達(dá)1%[13]，更易于工業(yè)化生產(chǎn).在葉綠素生產(chǎn)過程中加堿皂化產(chǎn)生大量富含植物醇、類胡蘿卜素和葉黃素[14]等物質(zhì)的不皂化物，有研究者對生產(chǎn)葉綠素及銅鈉鹽后所得廢液中的β-胡蘿卜素[15,16]、果膠[17]及黃酮類化合物[18]提取工藝進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，但對其中單體化合物并未有深入研究，且目前國內(nèi)外關(guān)于蠶沙葉綠素不皂化物中的化學(xué)成分未見相關(guān)研究報(bào)道.

目前國內(nèi)企業(yè)年產(chǎn)葉綠素100噸以上，每年積累幾百噸不皂化物副產(chǎn)物，因此深入研究不皂化物中的化學(xué)成分具有重要意義.立足于蠶沙前期處理研究，本文重點(diǎn)探究蠶沙葉綠素不皂化物中的化學(xué)成分，為蠶沙資源的進(jìn)一步綜合利用提供研究資料，為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝研究開發(fā)提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 原料 蠶沙葉綠素不皂化物(四川省通世達(dá)生物科技有限公司提供)；豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇對照品(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司).

2.1.2 試劑 石油醚(60～90)、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮(分析純，成都科龍化工試劑廠)，甲醇(色譜純，成都科龍化工試劑廠).

2.1.3 儀器 玻璃層析柱(150 mm×600 mm)；R201D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義英峪高科儀器廠)；LC3000高效液相色譜儀(UV3000紫外檢測器、P3000高壓輸液泵，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Sepax Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；MCI GEL(上海廈美生化科技發(fā)展有限公司)；制備色譜柱(YMC-C18-10μm，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；MicrOTOFQⅡ(德國Bruker公司)；Bruker AvanceⅡ-400MHz和Bruker AvanceⅡ-600MHz spectrometer(德國Bruker公司).

2.2 方 法

2.2.1 分離純化 取400 g蠶沙葉綠素不皂化物用適量石油醚加熱溶解，加入適量硅膠拌勻晾干，干法裝柱，干法上樣，敲擊柱體，保證色譜層平整緊實(shí).層析柱分別用石油醚/乙酸乙酯體積比(100∶0、 50∶1、 20∶1、 5∶1、 2∶1、 0∶1)梯度洗脫.收集洗脫液，經(jīng)TLC追蹤檢測合并相同餾分，減壓濃縮得到6個(gè)粗分段，分別為Fr.1(58 g)、Fr.2(42 g)、Fr.3(39 g)、Fr.4(24 g)、Fr.5(51 g)、Fr.6(15 g).Fr.1段石油醚結(jié)晶得到白色蠟狀固體，經(jīng)C18中壓色譜柱分離得到高純度化合物11.Fr.2段二次過硅膠柱，TLC檢測回收得到Fr.2-A-D.經(jīng)HPLC檢測分析，合并AB和CD，得到Fr.2-AB(8.6 g)、Fr.2-CD(12.86 g)先后通過MCI柱粗分離，甲醇洗脫；再重復(fù)多次經(jīng)C18中壓色譜柱分離，90%～100%甲醇洗脫，F(xiàn)r.2-CD得到化合物1(1.6 g)，F(xiàn)r.2-AB得到化合物2(145 mg).Fr.3段經(jīng)硅膠柱分離，得到含有7～9三個(gè)化合物含量較多的兩個(gè)粗組分Fr.3-A(19.67 g)和Fr.3-B(10.32 g).兩個(gè)分段經(jīng)過C18中壓色譜柱和高壓制備色譜柱進(jìn)行細(xì)分離，均用90%～100%甲醇梯度洗脫，經(jīng)過反復(fù)柱層析分離，HPLC檢測，分別得到純度較高的化合物7(320 mg)、8(600 mg)和9(31 mg).Fr.4經(jīng)過TLC、HPLC檢測對照品分析，富含甾醇類化合物3,4,5,6,10，先經(jīng)MCI柱甲醇洗脫初步除雜，后進(jìn)行C18中壓色譜柱分離得到Fr.4-A,B,C.Fr.4-A經(jīng)C18中壓色譜柱，90%～100%甲醇洗脫，得到化合物3(1.39 g)，F(xiàn)r.4-B經(jīng)過多次C18中壓色譜柱和高壓制備色譜柱，90%～100%甲醇洗脫得到化合物10(73 mg)，F(xiàn)r.4-C經(jīng)過多次C18中壓色譜柱分離得到化合物4(43 mg),5(40 mg),6(78 mg).Fr.5用乙醇、丙酮等溶劑結(jié)晶可得到大量化合物6.Fr.6經(jīng)HPLC檢測未發(fā)現(xiàn)含量較高的成分，故不再進(jìn)行分離.

2.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 本文通過分離純化和重結(jié)晶得到高純度的單體化合物，用氘代試劑溶解，利用質(zhì)譜、核磁氫譜、碳譜等波譜技術(shù)進(jìn)行測定.查閱文獻(xiàn)，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和化合物的理化性質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定.

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:297.23[M-H]+.TLC結(jié)果顯示該化合物和植物醇標(biāo)品的Rf值和斑點(diǎn)形狀一致.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物出峰時(shí)間與植物醇標(biāo)品一致，且混合進(jìn)樣顯示為同一物質(zhì)，故化合物1鑒定為植物醇(Phytol)，分子式C20H40O.

化合物2：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.98[M-H]+.1H-NMR(400HMz,DMSO)б:3.47(1H,t,J=3.11 Hz,H-3，-OH), 5.54、5.52 (1H,d,J=6 Hz,H-6,雙鍵質(zhì)子氫),0.98～1.16(3H,s,取代甲基氫),1.31～1.84(1H,m,質(zhì)子氫取代).13C-NMR (101 MHz, DMSO)δ:18.02(C-1)，27.98(C-2),74.36(C-3),40.14(C-4),142.65(C-5),118.86(C-6),19.07(C-7),46.82(C-8),34.04(C-9),49.53(C-10),32.62(C-11),29.53(C-12),38.67(C-13),35.47(C-14),28.93(C-15),34.24(C-16),29.83(C-17),42.50(C-18),34.09(C-19),27.9(C-20),32.60(C-21),37.27(C-22),27.76(C-23),28.93(C-24),15.87(C-25),19.07(C-26),17.93(C-27),29.53(C-28),32.14(C-29),31.63(C-30).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故化合物2鑒定為5-Glutinen-3-ol，分子式為C30H50O.

化合物3：白色羽狀結(jié)晶，ESI-MS at m/z:427.12[M-H]+.1H-NMR(400HMz,CDCl3)б:4.57(d，J=2.6 Hz,H-20a)；4.65(d，J=2.4 Hz,H-20b)；3.20(dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，0.74～1.71(3H，s，取代甲基氫).13C-NMR (101 MHz, CDCl3)δ:38.72(C-1)，27.46(C-2),79.01(C-3),38.87(C-4),55.31(C-5),18.02(C-6),34.29(C-7),40.84(C-8),50.45(C-9),37.18(C-10),20.94(C-11),25.15(C-12)，38.06(C-13)，43.01(C-14),28.00(C-15),35.60(C-16),42.84(C-17),48.31(C-18),48.00(C-19),150.99(C-20),29.86(C-21),40.02(C-22),29.71(C-23),15.39(C-24),15.99(C-25),16.13(C-26),14.56(C-27),18.33(C-28),109.34(C-29),19.32(C-30).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]基本一致，故化合物3鑒定為羽扇豆醇(Lupeol)，分子式為C30H50O.

化合物4：白色粉末，ESI-MS at m/z:412.64[M-H]+.TLC結(jié)果顯示該化合物與豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值和斑點(diǎn)形狀一致.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物的出峰時(shí)間與豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品一致，且混合進(jìn)樣顯示是同一物質(zhì).故化合物4鑒定為豆甾醇(Stigmasterol)，分子式為C29H48O.

化合物5：白色粉末，ESI-MS at m/z:400.70[M-H]+.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物的出峰時(shí)間與菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)品一致，且混合進(jìn)樣顯示為同一物質(zhì).故鑒定化合物5為菜油甾醇(Campesterol)，分子式C28H480.

化合物6：白色針狀結(jié)晶，ESI-MS at m/z:415.12[M-H]+.TLC結(jié)果顯示該化合物與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品Rf值和斑點(diǎn)形狀一致.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物的出峰時(shí)間與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品一致，且混合進(jìn)樣為同一物質(zhì).故化合物6鑒定為β-谷甾醇(β-sitosterol)，分子式C29H50O.

化合物7：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:430.51[M-H]+.1H-NMR(400 MHz,CDCl3)б:4.22(1H,s,-OH),2.5(2H,t,J=6.5 Hz,H-4),2.15(3H,s,H-10),2.11(6H,s,H-5a,H-7a),1.25(3H,m,H-2a),0.85(6H,m,H-12′a,H-13′),0.82(3H,m,H-8′a),0.83(3H,m,H-4′a).13C-NMR(101 MHz,CDC13)δ:75.4(C-2)，23.7(C-2a)，32.1(C-3)，20.6(C-4)，117.5(C-4a),118.8(C-5),11.9(C-5a),144.7(C-6),121.0(C-7),12.3(C-7a),122.4(C-8),145.6(C-8a),11.5(C-8b),39.7(C-1′),24.8(C-2′),37.3(C-3′,C-5′),32.9(C-4′),21.2(C-6′),37.3(C-7′,C-9′),32.6(C-8′),24.5(C-10′),39.6(C-11′),28.0(C-12′),22.5(C-12′a),22.3(C-13′),19.8(C-4′a),19.7(8′a).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致, 故化合物7鑒定為α-生育酚 (α-tocopherol)，分子式為C29H50O2.

化合物8：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:416.54[M-H]+.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：4.20(1H,s,6-OH),1,67 (2H,m,H-3), 2,68 (2H,t,J= 7.3 Hz,H-4), 6,37(1H,s, H-5), 1,22-1,28 (2H，m，H-1′2′3′5′6′7′9′10′11′),0,83 (1H,d,J=6.7 Hz,H-4′,H-8′,H-12′,H-13′),1,23 (3H,s,H-2),2,12 (3H,s,H-7),2,09 (3H,s,H-8).13C-NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 75.48(C-2),31.40(C-3),22.34(C-4),112.14(C-5),146.23(C-6),121.61(C-7),125.81(C-8),145.76(C-9),118.32(C-10),40.05(C-1′),21.03(C-2′),37.47(C-3′),32.70(C-4′),37.30(C-5′),24.46(C-6′),37.48(C-7′),32.82(C-8′),37.44(C-9′),24.82(C-10′),39.39(C-11′),28.00(C-12′),22.65(C-13′),24.10(CH3-C-2),11.92(CH3-C-7),11.88(CH3-C-8),19.68(CH3-C-4′),19.77(CH3-C-8′),22.74(CH3-C-12′).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]基本一致，故化合物8鑒定為γ-tocoferol，分子式C28H48O2.

化合物9：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.7[M-H]+.1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.44(1H,t,J=6.8 Hz,H-2),5.10(5H,t,J=7.1 Hz,H-6,H-10,H-11,H-18,H-22)，4.16(2H,d,J=6.9 Hz,H-1),2.09(10H,m,H-4,H-5,H-8,H-9,H-12),1.98(10H,m,H-13,H-16,H-17,H-20,H-21),1.67(3H,s,24-CH3),1.62(18H,s,C-3-CH3,C-7-CH3,C-11-CH3,C-15-CH3,C-19-CH3, C-23-CH3).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ:59.43(C-1),124.42,124.28,124.25,124.18,123.76,123.32(C-2,C-6,C-10,C-14,C-18,C-22),139.89,135.43,135.04,134.98,134.96,134.95(C-3,C-7,C-11,C-15,C-19,C-23),29.72,26.78,26.72,26.68,26.34(C-4,C-8,C-12,C-16,C-20),39.76,39.74,39.57(C-5,C-9,C-13,C-17,C-21),25.71(C-24),17.70,16.31,16.04,16.02(C-25,C-26,C-27,C-28,C-29,C-30).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]基本一致，故化合物9鑒定為(2E,6E,10E,14E,18E,22E)-3,7,11,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22- tetracosahexaen-1-ol，分子式為C30H50O.

化合物10：白色蠟狀固體,ESI-MS at m/z:427.6[M-H]+.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.31(1H,t,J=6.8 Hz,H-7),5.13(1H,t,J=6.5 Hz,H-24),3.27(1H,dd,J=4.6,10.7 Hz,H-3),1.69(3H,s,CH3-26),1.60(3H,s,CH3-27),0.98(3H,s,CH3-29),0.99(3H,s,CH3-30),0.90(3H,s,CH3-28),0.89(3H，s，CH3-21)，0.83(3H,s,CH3-19)，0.77(3H,s,CH3-18).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:37.2(C-1),25.36(C-2),79.27(C-3),38.97(C-4),50.62(C-5),23.95(C-6),117.79(C-7),145.90(C-8),48.91(C-9),34.94(C-10),18.15(C-11),33.96(C-12),43.53(C-13),51.28(C-14),33.82(C-15),28.48(C-16),53.23(C-17),22.09(C-18),13.11(C-19),35.80(C-20),18.60(C-21),35.16(C-22),27.61(C-23),125.14(C-24),130.96(C-25),25.75(C-26),17.68(C-27),27.69(C-28),14.74(C-29),27.32(C-30).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]基本一致，故化合物10鑒定為(13α,14β,17α,20R)-7,24-二烯羊毛甾烷-3-醇((13α,14β,17α,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol),分子式C30H50O.

化合物11：白色蠟狀固體，ESI-MS at m/z:256.0[M-H]+,1H-NMR (400MHz,CDCl3)δ:2.36(2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.65(2H,m,H-3),1.27～1.32(22H, m,H-4～14),1.34(2H,m,H-15),0.90(3H,t,J=6.5 Hz,H-16).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:179.6(C-1),34.1(C-2),24.6(C-3),29.8-29.0(C-4-C-13),31.8(C-14),22.6(C-15),14.2(C-16).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25，26]基本一致，故化合物11鑒定為棕櫚酸(palmitic acid)，分子式為C16H32O2.

圖2 化合物1～11結(jié)構(gòu)式Fig 2 Chemical structures of conpounds 1～11

4 討 論

經(jīng)過分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，從蠶沙葉綠素不皂化物中分離得到11種化合物，包括6種甾醇類物質(zhì)，2種萜類物質(zhì)，2種生育酚及棕櫚酸.其中化合物2,9,10為首次從蠶沙中分離得到.結(jié)果可知，蠶沙葉綠素不皂化物中富含甾醇類物質(zhì)，其中，β-谷甾醇、豆甾醇是葉綠素不皂化物中兩種主要的植物甾醇；其次是菜油甾醇和羽扇豆醇，在眾多的研究報(bào)道[27-29]中已經(jīng)證實(shí)了它們具有抗炎、抗腫瘤和降低膽固醇等多種良好的藥理活性，目前在食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用.最后，本文研究首次在蠶沙中分離出兩種新的甾醇類物質(zhì)5-Glutinen-3-ol與(13,14,17,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol，對后續(xù)蠶沙中甾醇研究有著重要意義.

此外，維生素E是一種脂溶性維生素，有著抗氧化[30]、抗衰老[31]、預(yù)防動脈粥硬化等功效，蠶沙葉綠素不皂化物中分離的α-生育酚和γ-生育酚是維生素E的兩種天然存在形式.植物醇也是維生素K合成中的重要原料.因此，蠶沙葉綠素不皂化物可作為生產(chǎn)甾醇類物質(zhì)和維生素E、維生素K的材料來源.本文研究明確了不皂化物相關(guān)化學(xué)成分，為蠶沙生產(chǎn)葉綠素過程中產(chǎn)生的相關(guān)副產(chǎn)物的深度利用提供了研究資料.