李慧堂，張岱男,2，張新中，金保哲，肖 萌，李海明

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院河南省神經(jīng)修復重點實驗室，河南 衛(wèi)輝 453100；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院,北京 100071)

創(chuàng)傷性腦損傷指由外部物理力量造成的正常大腦功能的破壞，其包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷在撞擊的瞬間發(fā)生，是不可逆的[1-2]；繼發(fā)性損傷為原發(fā)性損傷后導致腦組織缺氧缺血，發(fā)生氧化應(yīng)激、腦水腫、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等[3]，給予有效干預可逆轉(zhuǎn)。有證據(jù)表明，繼發(fā)性腦損傷在很大程度上決定了腦外傷患者的預后[4]。盡管隨著時代的發(fā)展，在手術(shù)技術(shù)和術(shù)后管理方面取得了巨大進步，但結(jié)果仍不令人滿意，需要能夠促進創(chuàng)傷性腦損傷患者神經(jīng)功能修復的新型藥物。黃芪甲苷是從黃芪中提取的三萜皂苷，是黃芪的主要活性成分之一，具有清除自由基、抗炎、抗凋亡、促進血管新生、促神經(jīng)修復等作用，是潛在的神經(jīng)保護劑[5-8]，但關(guān)于黃芪甲苷對創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)保護機制的報道很少。因此，本實驗觀察了黃芪甲苷對創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能、腦水腫、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 選取120只2月齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(200±20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，質(zhì)量合格證號：SCXK(魯)20190003。在河南省神經(jīng)修復重點實驗室標準化動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)在清潔級條件下，自然晝夜照明，通風良好，溫度(25±2)℃，濕度控制在(55±5)%，飼以國家標準嚙齒類動物飼料，自由飲食水，所有大鼠自購買后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，檢查無異常后再用于實驗。

1.2主要試劑與儀器 黃芪甲苷(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；HE染色試劑盒、尼氏染色試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自深圳市達科為生物工程有限公司；TUNEL試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；10%水合氯醛購自碧云天生物科技有限公司；大鼠自由落體打擊器購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；醫(yī)用顯微手術(shù)顱鉆購自上海光電技術(shù)有限公司；石蠟切片機購自上海華駿醫(yī)療器械有限公司；組織包埋機購自孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；4 ℃離心機購自賽默飛世爾科技公司；倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司。

1.3分組、造模與干預方法 將120只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃芪甲苷組，每組40只。模型組和黃芪甲苷組采用改良Feeney DM自由落體硬膜外撞擊法造模：大鼠術(shù)前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.34 mL/100 g)麻醉后，頂枕部備皮，俯臥位將大鼠頭部固定于打擊器底座，消毒鋪巾；沿矢狀縫切開一長約3 cm縱向切口，逐步游離軟組織及骨膜以暴露顱骨，在人字縫前2.0 mm、顱骨中線右側(cè)旁2.0 mm處鉆一直徑為5 mm的圓形骨窗，保護硬膜完整；以50 g砝碼，沿金屬套管自20 cm的高處自由落體打擊大鼠骨窗，造成大鼠右側(cè)大腦半球創(chuàng)傷性腦損傷；造模成功后，壓閉止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮；假手術(shù)組只頭皮切開、游離骨膜、鉆開骨窗，不進行自由落體打擊。術(shù)后6 h評估改良神經(jīng)功能缺損嚴重程度評分(mNSS)，>2分表明造模成功[9]。黃芪甲苷組于腦損傷后給予黃芪甲苷20 mg/(kg·d)腹腔注射，假手術(shù)組和模型組每天給予等量0.9%NaCl腹腔注射，直至處死。

1.4檢測指標及方法

1.4.1神經(jīng)功能缺損程度評分 由非參與本實驗且經(jīng)過評價學習的2名實驗人員于造模后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d對各組大鼠進行mNSS評分，mNSS評分包括運動(肌肉狀態(tài)、異常運動)、感覺(視覺、觸覺、本體感覺)、反射和平衡測試，總分為 0～18分，正常為0分，分值越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4.2腦含水量 分別于造模后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d隨機從各組中各取6只大鼠，用10%水合氯醛(0.34 mL/100 g)腹腔注射深度麻醉，于冰上快速斷頭取腦，電子分析天平稱濕重，然后用濾紙吸除表面水分及血漬，統(tǒng)一標準重量錫紙包裹，置入100 ℃烘箱烘烤24 h取出，恢復到室溫后稱干重，反復稱量至恒重(最后兩次重量之差小于0.2 mg)。由非參與本實驗且經(jīng)過腦含水量測定學習的2名實驗人員進行腦含水量測定，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.3HE及尼氏染色腦組織病理觀察 每組選取造模后3 d大鼠5只，以10%水合氯醛(0.34 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋切片，行HE和尼氏染色，鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細胞病理形態(tài)學。

1.4.4損傷灶及周圍腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況切片獲取方法同“1.4.3”，嚴格按TUNEL試劑盒說明步驟進行檢測。在高倍鏡下觀察，凋亡神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)為不均一的紅色，正常神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)為藍色，以Image J軟件計數(shù)視野內(nèi)凋亡神經(jīng)元細胞。凋亡率=陽性細胞數(shù)/(陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù))×100%。

1.4.5損傷灶及周圍腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量 每組選取造模后3 d大鼠5只，以10%水合氯醛(0.34 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭取出全腦，取損傷灶及邊緣2 mm區(qū)域，按照腦濕重：生理鹽水100 mg:0.9 mL的比例進行組織勻漿，經(jīng)短暫超聲處理，離心后取其上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6和IL-1β含量，嚴格按照ELISA試劑盒內(nèi)所附說明書步驟進行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損mNSS評分比較 造模后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d，模型組、黃芪甲苷組mNSS評分均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)，且造模后12 h mNSS評分最高，此后逐漸降低；造模后12 h，黃芪甲苷組mNSS評分與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模后1 d、3 d、5 d、7 d，黃芪甲苷組mNSS評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和腦損傷各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損mNSS評分比較分)

2.2各組大鼠腦組織含水量比較 造模后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d，模型組、黃芪甲苷組腦組織含水量均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)，且造模后3 d腦組織含水量達到峰值，之后逐漸降低；造模后12 h、1 d，黃芪甲苷組腦組織含水量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；造模后3 d、5 d、7 d，黃芪甲苷組腦組織含水量均明顯低于同期模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和腦損傷各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較

2.3各組大鼠腦組織病理表現(xiàn) 造模3 d后，HE染色顯示：假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)規(guī)則，排列有序，核仁清晰可見，胞漿染色均勻；模型組腦組織細胞胞體腫脹，形態(tài)不規(guī)則，部分胞核皺縮，血管擴張，并可見炎性細胞浸潤；與模型組比較，黃芪甲苷組腦組織細胞腫脹數(shù)目減少且程度較輕，間隙變小，胞體及核仁皺縮數(shù)目下降，僅個別血管擴張，可見少量炎性細胞浸潤。大腦皮質(zhì)神經(jīng)元尼氏染色顯示：假手術(shù)組神經(jīng)元細胞排列有序，形態(tài)規(guī)則，尼氏體染色均勻、清晰，且數(shù)量較多；模型組損傷灶及周圍腦組織神經(jīng)元細胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并可見壞死及胞核固縮；與模型組比較，黃芪甲苷組神經(jīng)元細胞數(shù)量及尼氏體數(shù)量明顯增加，正常形態(tài)細胞稍多，神經(jīng)元損傷較輕。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和腦損傷各組大鼠腦損傷后3 d腦組織病理表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況 造模3 d后，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡較少，神經(jīng)細胞凋亡率為(11.52±2.16)%；模型組及黃芪甲苷組大鼠腦組織神經(jīng)元細胞凋亡明顯，神經(jīng)細胞凋亡率分別為(76.77±5.20)%、(61.48±4.29)%，均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，但黃芪甲苷組神經(jīng)細胞凋亡率明顯低于模型組(P<0.05)。TUNEL染色表現(xiàn)見圖2。

圖2 假手術(shù)組和腦損傷各組大鼠腦損傷后3 d損傷灶周圍腦組織細胞凋亡情況(×400)

2.5各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較 造模3 d后，模型組和黃芪甲苷組大鼠損傷灶及周圍腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，但黃芪甲苷組各指標均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 假手術(shù)組和腦損傷各組大鼠腦損傷后3 d腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

3 討 論

創(chuàng)傷性腦損傷是一個重要的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)生率約為5 000萬人次/年，在中國，腦損傷死亡率約為13/10萬人[10]。創(chuàng)傷性腦損傷除了損傷后立即由機械力造成的原發(fā)損傷外，腦損傷還可促進腦組織的延遲死亡，即繼發(fā)性損傷[11]。如何有效阻止創(chuàng)傷性腦損傷后的腦水腫、氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細胞凋亡等繼發(fā)性損傷對神經(jīng)功能恢復具有重要意義。

黃芪甲苷是一種羊毛脂-醇型四環(huán)三萜皂甙，具有多種生物活性，在我國使用已久，無明顯的肝腎毒性作用[12]。本研究通過建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，探討了黃芪甲苷對創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用及可能機制。創(chuàng)傷性腦損傷導致一系列細胞外和細胞間事件，包括炎癥細胞的浸潤，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的破壞，神經(jīng)元功能障礙和死亡。神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞是組成神經(jīng)組織的基本組成成分，而尼氏體為神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的主要場所，與神經(jīng)元功能的發(fā)揮聯(lián)系密切[13]。當神經(jīng)元變性死亡時，尼氏體可出現(xiàn)數(shù)量及位置的變化，甚至溶解，因此尼氏體的數(shù)量可以反映神經(jīng)元胞體損傷情況[14]。本實驗結(jié)果顯示，黃芪甲苷干預后各時間點大鼠mNSS評分均較低(黃芪甲苷干預12 h差異不明顯考慮與藥物作用時間較短有關(guān))，并隨損傷時間延長明顯降低。對大鼠腦組織進行HE及尼氏染色發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后腦組織細胞胞體腫脹，神經(jīng)元可見核固縮、壞死，同時細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，血管擴張，并可見炎性細胞浸潤；黃芪甲苷干預后，腦組織細胞腫脹數(shù)目減少且程度減輕，神經(jīng)元細胞數(shù)量、尼氏體數(shù)量增多，神經(jīng)元損傷較輕。說明黃芪甲苷可以改善神經(jīng)功能缺損，減輕神經(jīng)細胞損傷，促進神經(jīng)修復。

腦水腫是腦組織對創(chuàng)傷性腦損傷的一種病理生理反應(yīng)，其病理改變主要是由于腦細胞代謝紊亂、血腦屏障受損、組織液循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)等所致。腦水腫會引起細胞胞體腫脹，改變腦組織細胞代謝物濃度，導致能量代謝障礙，引起顱內(nèi)壓迅速增加，導致大腦功能障礙。本實驗結(jié)果顯示，模型組和黃芪甲苷組腦組織含水量顯著升高，創(chuàng)傷后3 d腦組織含水量達到峰值，之后逐漸下降，與腦損傷后由血腦屏障破壞引起的腦組織水腫恰恰在損傷后 48～72 h達到高峰[15]相一致；且與模型組比較，黃芪甲苷組腦含水量更低(黃芪甲苷干預12 h、1 d與模型組比較差異不明顯考慮與藥物作用時間較短有關(guān))。說明黃芪甲苷能夠減輕腦損傷后血腦屏障的破壞，降低毛細血管通透性，減輕腦水腫。

細胞凋亡在創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織繼發(fā)性損傷中扮演著重要角色，其特征是細胞萎縮、染色質(zhì)濃縮、DNA降解和碎裂及細胞分裂成凋亡小體，隨后被吞噬細胞吞噬和降解[16]。細胞凋亡的調(diào)控在保護神經(jīng)元和改善認知方面起著重要作用[17]。以往研究表明，細胞凋亡主要有兩種信號通路，即內(nèi)源性(線粒體)信號通路和外源性(死亡受體)信號通路[18]，內(nèi)源性凋亡刺激因子(Cyt C)、外源性死亡配體(Bcl-2家族蛋白)和下游Caspase家族成員(Capase-3、Capase-7、Capase-9)最終激活線粒體途徑[19]。另外，越來越多的研究表明自噬也與細胞凋亡密切相關(guān)。黃芪甲苷可能通過抑制死亡受體途徑和線粒體途徑中關(guān)鍵因子的激活以及調(diào)節(jié)自噬來減輕細胞凋亡[6，20]。本實驗結(jié)果顯示，創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠腦組織神經(jīng)元細胞凋亡明顯，黃芪甲苷干預后神經(jīng)細胞凋亡率明顯降低，證實黃芪甲苷可以通過抑制細胞凋亡來減輕創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性損傷。

創(chuàng)傷性腦損傷后的炎癥反應(yīng)機制為腦組織缺氧缺血及細胞炎癥因子釋放進入中樞神經(jīng)組織。細胞炎癥因子具有廣泛活性，可進一步導致血腦屏障破壞、神經(jīng)細胞死亡等，從而加重了腦水腫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[21]。由星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞分泌的促炎細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，廣泛存在于病變部位，是有效評估創(chuàng)傷性腦損傷患者炎癥反應(yīng)的指標。本實驗結(jié)果顯示，模型組腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量較假手術(shù)組明顯增高，表明顱腦損傷使抗炎能力減弱，促進神經(jīng)損傷；黃芪甲苷組IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯低于模型組，提示黃芪甲苷可提高創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的抗炎能力，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

綜上所述，黃芪甲苷具有明顯神經(jīng)保護作用，其可能通過減輕腦組織水腫和神經(jīng)細胞損傷、抑制細胞凋亡及中樞性炎癥反應(yīng)減輕創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。