譚駿嵐，任麗芝，龍夢(mèng)鈴，李 寧，林宏遠(yuǎn)，梁 慧

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410031)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌及乳腺癌，排第三位，其病死率在女性中僅次于肺癌排第二位，在男性中僅次于肺癌及肝癌排第三位[1]。盡管近年來(lái)對(duì)結(jié)直腸癌患者全身治療的療效有所提升，但晚期患者的5年生存率仍只有12%～14%[2]。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵的免疫抑制細(xì)胞，在對(duì)不同癌癥患者的血清及腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了MDSCs增多[3-4]。在結(jié)直腸癌中，MDSCs在患者的外周血及腫瘤組織中同樣有著高表達(dá)[5]，且MDSCs與病情進(jìn)展存在正相關(guān)性[6]。對(duì)T細(xì)胞的顯著抑制作用是MDSCs的重要特征，其中MDSCs可通過(guò)增強(qiáng)gp91phox、p47phox的表達(dá)分泌大量的活性氧(ROS)而抑制CD8+T細(xì)胞的免疫功能[7]。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，可通過(guò)分泌免疫促進(jìn)相關(guān)因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)和行使細(xì)胞毒性作用來(lái)拮抗結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)治療結(jié)直腸癌在提高患者的生活質(zhì)量、減輕放化療毒副反應(yīng)、緩解臨床癥狀、調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮了重要作用[8-10]。目前中藥單體靶向MDSCs而發(fā)揮抗腫瘤作用已被證實(shí)[11-12]，但針對(duì)復(fù)方及對(duì)腸癌MDSCs的相關(guān)研究開(kāi)展較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腸復(fù)方可以通過(guò)抑制小鼠外周血及瘤體MDSCs的增殖，提高腸癌小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的活性而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)基于前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，通過(guò)觀察經(jīng)腸復(fù)方含藥血清干預(yù)后的腸癌MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞免疫功能的影響，探究其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)雌性SD大鼠20只，體重(200±20)g；SPF級(jí)BALB/c小鼠20只，雌性，5～6周齡，體重(20±2)g。大小鼠均購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，在SPF級(jí)別下飼養(yǎng)于湖南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，予以自由飲食飲水。

1.2細(xì)胞 結(jié)腸癌CT26細(xì)胞(編號(hào)：ZQ0190)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.3藥物 腸復(fù)方由黨參10 g、黃芪30 g、白術(shù)15 g、茯苓10 g、陳皮10 g、薏苡仁30 g、莪術(shù)15 g、土鱉蟲(chóng)15 g、半枝蓮30 g、百花蛇舌草30 g、壁虎12 g、甘草6 g等組成，所有中藥購(gòu)自湖南省腫瘤醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部中藥鑒定員鑒定后使用。香菇菌多糖片(湖北廣仁藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號(hào)：2003015)。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 胎牛血清(批號(hào)：040011ACS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)：R8758500ML)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠CD8+T細(xì)胞分選磁珠(批號(hào)：130104075)、小鼠MDSC細(xì)胞分選磁珠(批號(hào)：130094538)、Gr-1流式抗體-PE(批號(hào)：12593181)、LS分選柱(批號(hào)：130042401)均購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；CD11b流式抗體-FITC(批號(hào)：11011281)、CD8流式抗體-PE(批號(hào)：12008181)、Anti-CD3e(批號(hào)：16003182)、Anti-CD28(批號(hào)：16028182)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；IL-2(批號(hào)：KE1004)、IFN-γ(批號(hào)：KE1001)ELISA試劑盒，小鼠gp91phox一抗(批號(hào)：190131AP)，小鼠β-actin一抗(批號(hào)：600081Ig)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(批號(hào)：SA000011)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；小鼠p47phox一抗(批號(hào)：ab795)購(gòu)自英國(guó)abcam公司；ROS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033)購(gòu)自上海碧云天公司；低速離心機(jī)(SL02，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器公司)，流式細(xì)胞分析儀(A0011102，美國(guó)Beckman公司)；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱(DH160I，上海三藤儀器公司)蛋白質(zhì)電泳儀(DYY6C)、轉(zhuǎn)膜儀(DYCZ40D)均為北京六一生物科技公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)分析儀(MB530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H1650R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇CT26細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并傳代。

1.5.2結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，使用PBS液配制成細(xì)胞密度為1×107/mL的單細(xì)胞懸液。用1.0 mL注射器，按照每只0.2 mL的量分別注射于BALB/C小鼠右腋皮下，建立小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，正常飼養(yǎng)21 d，不予干預(yù)。

1.5.3模型小鼠脾臟MDSCs和外周血CD8+T細(xì)胞的分離純化 乙醚吸入麻醉荷瘤小鼠，無(wú)菌操作摘取小鼠眼球采血，拉頸處死小鼠后，取脾臟并研磨，加無(wú)菌紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，4 ℃下1 500 r/min離心10 min，去上清后加700 μL Buffe重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108個(gè)。加50 μL小鼠FcR抗體，4 ℃孵育10 min，隨后加入CD11b-FITC混勻，室溫避光孵育30 min。孵育后加入100 μL抗Gr-1抗體混勻,4 ℃孵育10 min。孵育結(jié)束后加5 mL Buffe洗滌，4 ℃下1 500 r/min離心10 min棄去上清。用800 μL buffer重懸細(xì)胞,加入200 μL免疫磁珠抗體,4 ℃孵育15 min。孵育后用10 mL Buffe重懸，4 ℃下1 500 r/min離心10 min后去上清。準(zhǔn)備好磁珠分選器及操作臺(tái)，將LS分離柱置于磁性分選器中，緩慢過(guò)柱，快過(guò)完柱時(shí)，用緩沖液沖洗LS分選柱，將在分選柱上的細(xì)胞快速用活塞推入離心管，收集細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定MDSCs的活性，隨后上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)，Gr-1+CD11b+為 MDSCs細(xì)胞群。取小鼠新鮮外周血，用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，40 μL buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)。加入CD8磁珠mAb混勻，4 ℃孵育15 min，過(guò)柱分選CD8+T細(xì)胞，余法同上，收集細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定CD8+T細(xì)胞的活性，隨后上機(jī)流式檢測(cè)，CD8+為CD8+T細(xì)胞群。

1.5.4腸復(fù)方含藥血清的制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將20只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、香菇多糖組及腸復(fù)方高、中、低、劑量組，每組4只。采用人(60 kg)與大鼠(200 g)等效劑量計(jì)算，以60 kg人每日生藥劑量為280 g計(jì)算，200 g大鼠給藥劑量為25 g/kg，則腸復(fù)方高、低劑量組分別為50 g/kg和12.5 g/kg。大鼠給藥量的標(biāo)準(zhǔn)為2 mL/100 g體重，因此每只大鼠每天給藥4 mL，則腸復(fù)方高、中、低劑量組分別給予5 g/mL、2.5 g/mL、1.25 g/mL的腸復(fù)方液灌胃。香菇多糖組給予蒸餾水配成的0.37 mg/mL香菇多糖藥液灌胃。模型組給予等體積的蒸餾水灌胃。各組每天灌胃2次，每次2 mL，連續(xù)7 d，灌胃前均禁食6 h。第7天末次灌胃1 h后，采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，1 000 r/min離心10 min收集血清，用0.22 μm微孔濾過(guò)器過(guò)濾血清，56 ℃水浴30 min滅活血清抗體及補(bǔ)體，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.5流式檢測(cè)MDSCs中ROS水平 將磁珠分選的MDSCs按1×105/100 μL每孔接種于24孔板中，分為空白血清組、香菇多糖組及腸復(fù)方低、中、高劑量組，分別添加相應(yīng)血清培養(yǎng)基200 μL，置于37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)懸浮生長(zhǎng)72 h。收集各組含藥血清干預(yù)72 h后的MDSCs，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，PBS洗1次；按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，稀釋好的DCFH-DA加入細(xì)胞沉淀中重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育20 min，每3～5 min混勻1次，離心收集細(xì)胞沉淀，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，用流式細(xì)胞儀、選擇FITC通道檢測(cè)，以平均熒光強(qiáng)度代表ROS水平高低。

1.5.6Western blot法檢測(cè)MDSCs中g(shù)p91phox、p47phox蛋白表達(dá)情況 取各組含藥血清干預(yù)后的MDSCs細(xì)胞裂解，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min后提取蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定總蛋白濃度。臨用前取蛋白總量相同的各樣品5×SDS上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用，隨后上樣于凝膠加樣孔內(nèi)在76 V恒定電壓下電泳130 min。隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，將膜浸入配制好的5%脫脂奶粉中，室溫放置60 min，再將膜分別浸入對(duì)應(yīng)一抗溶液(1∶1 000)中，4 ℃過(guò)夜，次日室溫放置30 min。取出膜后用PBST洗3次，每次15 min，分別浸入用HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)羊抗鼠IgG(1∶5 000)二抗溶液中，室溫放置60 min后用PBST洗3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光15 min；顯影沖洗，用Quantity One專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.5.7ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清液中IL2、IFN-γ水平 收集各組含藥血清干預(yù)后的MDSCs，和CD8+T細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)處理，同時(shí)加入anti-CD3(1 μg/mL)和anti-CD28(1 μg/mL)激活CD8+T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h。4 ℃下離心后取上清液。按照ELISA試劑盒中的操作說(shuō)明，檢測(cè)各組上清液中IL-2、IFN-γ水平。

2 結(jié) 果

2.1分選后MDSCs的活性及純度鑒定 腸癌小鼠分選后的MDSCs90%以上為活細(xì)胞，且純度為91.35%。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 腸癌小鼠髓源性抑制細(xì)胞活力檢測(cè)臺(tái)盼藍(lán)染色情況(×100)

圖2 腸癌小鼠髓源性抑制細(xì)胞純度檢測(cè)情況

2.2分選后CD8+T細(xì)胞的活性及純度鑒定 腸癌小鼠分選后的外周血CD8+T細(xì)胞90%以上為活細(xì)胞，且純度為99.78%。見(jiàn)圖3及圖4。

圖3 腸癌小鼠外周血CD8+ T細(xì)胞活力檢測(cè)臺(tái)盼藍(lán)染色情況(×100)

圖4 腸癌小鼠外周血CD8+ T細(xì)胞純度檢測(cè)情況

2.3各組MDSCs中ROS水平比較 腸復(fù)方中、高劑量組MDSCs中ROS水平均明顯低于空白血清組(P均<0.05)，且腸復(fù)高劑量組明顯低于腸復(fù)方中劑量組(P<0.05)；香菇多糖組與腸復(fù)方低劑量組MDSCs中ROS水平雖較空白血清組有下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 空白血清組和各含藥血清干預(yù)組腸癌髓源性抑制細(xì)胞中ROS水平

2.4各組MDSCs中g(shù)p91phox和p47phox蛋白表達(dá)情況比較 腸復(fù)方中、高劑量組MDSCs中g(shù)p91phox、p47phox蛋白表達(dá)量均明顯低于空白血清組(P均<0.05)，且腸復(fù)方高劑量組均明顯低于腸復(fù)方中劑量組(P均<0.05)；香菇多糖組、腸復(fù)方低劑量組MDSCs中g(shù)p91phox、p47phox蛋白表達(dá)量與空白血清組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖6及圖7。

圖6 空白血清組和各含藥血清干預(yù)組腸癌髓源性抑制細(xì)胞中g(shù)p91phox及p47phox蛋白印跡

圖7 空白血清組和各含藥血清干預(yù)組腸癌髓源性抑制細(xì)胞中g(shù)p91phox及p47phox蛋白表達(dá)灰度值

2.5各組共培養(yǎng)體系上清液中IL-2、IFN-γ水平比較 香菇多糖組及腸復(fù)方低、中、高劑量組共培養(yǎng)體系中IL-2、IFN-γ水平均明顯高于空白血清組(P均<0.05)，且腸復(fù)方低、中、高劑量組均明顯高于香菇多糖組(P均<0.05)，腸復(fù)方高劑量組明顯高于腸復(fù)方低、中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白血清組和各含藥血清干預(yù)組腸癌髓源性抑制細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清液中IL-2、IFN-γ水平比較

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，中醫(yī)稱(chēng)之為“腸蕈”“腸澼”“鎖肛痔”等。本課題組在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，“虛，濕，瘀，毒”并存是結(jié)直腸癌的核心病機(jī)特點(diǎn)，而虛、濕、瘀、毒等腫瘤病理因素與免疫狀態(tài)的相關(guān)性也是中醫(yī)藥發(fā)揮抗腫瘤作用的重要方面。故根據(jù)結(jié)直腸癌的特點(diǎn)，以健脾益氣扶正、祛濕化瘀解毒為基本法創(chuàng)立了腸復(fù)方作為治療該病的專(zhuān)方。方中黨參、白術(shù)、黃芪、甘草等健脾益氣扶正，茯苓、陳皮、薏苡仁、莪術(shù)、白花蛇舌草等祛濕化瘀解毒，全方配伍攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本兼顧。

MDSCs是腫瘤免疫抑制微環(huán)境中的關(guān)鍵免疫抑制細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。在各種人類(lèi)癌癥和小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs可以穩(wěn)定產(chǎn)生高水平的ROS[14]，ROS通過(guò)一系列反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸鹽(PNT)，PNT使與其接觸的CD8+T細(xì)胞受體復(fù)合物的酪氨酸氮化，這一過(guò)程使CD8+T細(xì)胞與特異性多肽-主要組織相容性復(fù)體(pMHC)結(jié)合發(fā)生障礙從而誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性耐受[15]，抑制機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。NADPH氧化酶亞基gp91phox和p47phox蛋白表達(dá)上調(diào)是腸癌MDSCs產(chǎn)生大量ROS的關(guān)鍵，因此抑制NADPH氧化酶亞基gp91phox和p47phox蛋白的表達(dá)而減少腸癌MDSCs中ROS的產(chǎn)生，將有可能提高結(jié)直腸癌患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使患者生存期延長(zhǎng)而達(dá)到臨床獲益。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：與空白血清組相比，香菇多糖組與腸復(fù)方低劑量組MDSCs中ROS水平及gp91phox、p47phox蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯降低，腸復(fù)方中、高劑量組均明顯降低，其中腸復(fù)方高劑量組降低更為明顯。提示腸復(fù)方可以調(diào)控腸癌MDSCs的分泌功能，通過(guò)抑制gp91phox、p47phox蛋白的表達(dá)而降低腸癌MDSCs中ROS水平，并呈一定的濃度依賴(lài)性。這可能與腸復(fù)方中含有具有調(diào)控MDSCs的藥物有關(guān)，如甘草有效成分甘草酸可降低MDSCs對(duì)環(huán)氧化酶2(COX2)、ARG1、iNOS等抑制性因子的生成[16]。莪術(shù)有效成分莪術(shù)果膠多糖可降低MDSCs的免疫抑制功能，促進(jìn)CD8+T、CD4+T細(xì)胞活化[12]。陳皮有效成分油皮素可抑制MDSCs的增殖[17]。通過(guò)進(jìn)一步將經(jīng)藥血清干預(yù)后的腸癌MDSCs與CD8+T細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖組及腸復(fù)方低、中、高劑量組中IL-2、IFN-γ水平均明顯高于空白血清組，其中以腸復(fù)方高劑量組升高最為明顯。說(shuō)明香菇多糖可減弱MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞抑制作用，但其作用不如腸復(fù)方強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中腸復(fù)方低劑量沒(méi)有顯示出對(duì)MDSCs中g(shù)p91phox、p47phox蛋白表達(dá)和ROS水平的調(diào)控作用，但能在一定程度上調(diào)控腸癌MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞抑制作用，分析原因可能是腸復(fù)方可能從多靶點(diǎn)調(diào)控MDSCs的功能，這也突顯了中醫(yī)藥防治結(jié)直腸癌的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，腸復(fù)方含藥血清可以減弱腸癌MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞免疫功能的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制gp91phox、p47phox蛋白表達(dá)而降低MDSCs中ROS水平相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。