崔 曉 孔 怡 唐麗娜 李秀梅

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山東泰安271000）

卵孢長根菇Hymenopellis raphanipes俗稱長根菇，屬于真菌界Eumycetes、擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、傘菌目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae，是珍稀的食藥用真菌之一[1]。長根菇肉質(zhì)細(xì)嫩，柄脆可口，營養(yǎng)豐富，富含氨基酸、維生素、微量元素等，所含的長根菇多糖[2]對治療腫瘤、降低血壓具有顯著作用。由此可見，長根菇食用、藥用價值較高，市場潛力大，開發(fā)前景廣闊。筆者分離采自泰山山脈的一株野生長根菇，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、rDNAITS序列分析鑒定，旨在為長根菇育種提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

一株野生長根菇子實體采自泰山山脈（東經(jīng)117.0405°，北緯36.1614°，海拔577 m），經(jīng)組織分離獲得純培養(yǎng)物，保存于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，編號為chang-202001。

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L。121 ℃滅菌30 min，然后倒平板，每平板定量為20 mL。

1.3 試驗主要試劑及儀器

主要試劑：真菌總DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：LDZX-75KBS 立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），SPX-250BS-II 恒溫培養(yǎng)箱、制冷恒溫?fù)u床、電泳儀、高速離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株純化

采用組織分離法[3]得到野生子實體的PDA 純培養(yǎng)物，待菌絲萌發(fā)后，3 次純化培養(yǎng)獲得菌絲純培養(yǎng)，編號為chang-202001。

1.4.2 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定方法采用宏觀形態(tài)特征、顯微結(jié)構(gòu)[1]相結(jié)合的方法。挑取菌塊于PDA 平板上進(jìn)行活化，定期觀察菌落特征；用插片法[4]觀察菌絲的顯微結(jié)構(gòu)。參照《中國大型真菌》[5]對chang-202001 進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察孢子印、子實體及附屬物等外觀特征，以及是否有特殊氣味；顯微觀察菌絲、孢子等特征。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

1.4.3.1 ITS序列擴(kuò)增與測序

采用真菌總DNA 提取試劑盒提取DNA 后，使用真菌ITS 通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物 序 列 為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應(yīng)體系50 μL：模板1 μL（約20 ng），2×PCR Taq Master Mix25 μL，0.4 nmol/L 正向引物和反向引物各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)平7 min，4 ℃終止反應(yīng)。

圖3 菌落形態(tài)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA 純化、測序，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心完成。1.4.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的ITS 序列用DNAMAN 進(jìn)行拼接，將拼接后的ITS 序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫，BLAST 檢索獲得多條同源性較高的rDNA ITS 參考序列（表1），采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析所用的rDNA ITS參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

野生長根菇子實體中等至稍大，菌蓋3.2~6.5 cm，半球形至漸平展，中部凸起或似臍狀，淺褐色至黑褐色。菌肉白色，薄。菌褶白色，較寬，不等長（圖1）。菌柄近菌蓋處顏色較深，淺褐色至褐色。孢子印白色，孢子無色，光滑，橢圓形或卵圓形。平板培養(yǎng)的菌落白色，邊緣整齊，氣生菌絲明顯；光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)，顯示菌絲有隔、無色透明，有分枝，具有鎖狀聯(lián)合。（圖2-圖4）條相似序列作為參考序列，以雞菌Termitomyces

圖1 野生長根菇子實體形態(tài)

圖4 菌株顯微形態(tài)（40×10）

2.2 分子鑒定

對菌株chang-202001 的rDNA ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測序，獲得長度為625 bp 的DNA 片段，將獲得的ITS 序列上傳至NCBI 獲得序列號（MT974249）并進(jìn)行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)其與Hymeno?pellis raphanipes中HKAS95783[1]的rDNA ITS 最為接近，相似度100%。從NCBI 數(shù)據(jù)庫內(nèi)下載已知的多clypeatus（KM657823）[6]為外群，運(yùn)用MEGA7.0 軟件Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5），并運(yùn)行1000 次以bootstrap 檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。由圖5 可知，菌株chang-202001 同3 個卵孢長根菇分離物（KX688238、KX688236、KX688232）聚為一簇，與中國臺灣地區(qū)的Hymenopellis raphanipesLC512057的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他來自不同國家和地區(qū)的同屬菌株的ITS 核苷酸一致率為94.98%~100.00%。

圖5 基于rDNA ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

長根菇肉質(zhì)細(xì)嫩，軟滑適口，在市場推廣后被稱為“雞肉絲菇”，因其形態(tài)和雞菌相似，故易被混淆。研究對采自泰山山脈的長根菇進(jìn)行分類鑒定，確定為卵泡長根菇H.raphanipes，為該地區(qū)長根菇育種工作提供了遺傳背景清晰的野生種質(zhì)資源，為下一步馴化選育和市場化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3 小結(jié)