趙 婧，馬 美，劉博學(xué)，陳思嬡，孫靜薇，蘇占海

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

我國(guó)胃癌分布呈現(xiàn)區(qū)域聚集性特征，青海地區(qū)漢族、撒拉族、回族發(fā)病率高于東南沿海地區(qū)。目前研究結(jié)果表明胃癌的發(fā)生與抑癌基因APC、p15、p16等的異常甲基化有關(guān)[1-3]。青海漢族、撒拉族、回族胃癌高發(fā)是否與NF2、EZR和p53甲基化異常相關(guān)，本研究采用基因組學(xué)法開(kāi)展相關(guān)研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，從青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院、青海紅十字醫(yī)院收集漢族、撒拉族、回族胃癌患者胃癌組織標(biāo)本各30例組成病例組、健康體檢者胃組織標(biāo)本各20例組成對(duì)照組。

1.2 試劑與儀器

DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司，中國(guó))，PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海生工公司，中國(guó))；瓊脂糖(上海生工公司，中國(guó))，亞硫酸氫鹽(上海生工公司，中國(guó))；恒溫水浴鍋(江蘇金壇公司，中國(guó))，低溫冷凍離心機(jī)(艾本德生命科學(xué)公司，德國(guó))，核酸蛋白濃度檢測(cè)儀(基因有限公司，美國(guó))，DYY-6C瓊脂糖電泳儀(北京六一公司，中國(guó))，凝膠成像儀(耶拿公司，德國(guó))，PCR儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，美國(guó))。

1.3 研究方法

1.3.1 組織DNA提取及濃度、純度的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)稱(chēng)取30 mg組織剪碎于離心管中，加入100 μL GA，用勻漿器勻漿，之后再加入100 μL GA，輕柔吹打使其均勻懸浮，提取組織中的DNA。取1 μL TE滴加于核酸蛋白濃度檢測(cè)儀進(jìn)行調(diào)零，滴加1 μL DNA樣品檢測(cè)其濃度，并記錄A260/A280值，該值在1.8～2.0之間提示DNA純度較高。

做完電泳(1%瓊脂糖凝膠)后在紫外燈下驗(yàn)證DNA的完整性。

1.3.2 DNA修飾

用亞硫酸氫鹽修飾DNA。

取DNA樣品2 μg于1.5 mL離心管中，加純水定容至50 μL，每管加入5.5 μL新配制的氫氧化鈉溶液(3.0mol/L)進(jìn)行水浴(42℃，30min)。期間，配制氫醌(10mmol/L)、亞硫酸氫鈉(3.6mmol/L)溶液，待水浴結(jié)束后，加30 μL氫醌、520 μL亞硫酸氫鈉溶液，將離心管以錫箔紙包裹(避光)，顛倒(輕柔)混勻。靜置片刻后放入水浴箱(50℃，避光，每管加200μL石蠟油，16h)。

1.3.3 NF2、EZR和p53基因甲基化的檢測(cè)

采用Methyl Primer Express v1.0軟件分析NF2、EZR、p53基因序列。設(shè)計(jì)引物序列分別為NF2-F 5′-AAG GGA AGT AGA GGG ATT TG-3′，NF2-R 5′-TAA CTA CAA TAA CAA TCA CTC TAA ATA C-3′；ezrin-F 5′-GTT GGT TGT TTT GGG ATT TTT TTT TTT TAG G-3′，ezrin-R 5′-CCC CRA AAA ACA CTC RAC CAA AAA AAT C-3′；p53-F 5′-GTT TTG TTA ATT GGT TAA GAT TTG TTT T-3′，p53-R 5′-TCATAAAACACCACCACACTATATC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為329、228、264 bp。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件分別見(jiàn)表1、表2。PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳(2%瓊脂糖凝膠)，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒操作步驟對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物與pGM-T載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，每個(gè)樣品挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物公司測(cè)序。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)條件

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以相對(duì)數(shù)n(%)表示，兩組或多組資料間比較采用卡方檢驗(yàn)或連續(xù)性校正進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 青海漢、撒拉、回族胃癌及正常胃組織NF2基因甲基化結(jié)果

亞硫酸氫鹽亞克隆測(cè)序結(jié)果顯示，青海漢、撒拉、回族胃癌及正常胃組織中NF2基因的15個(gè)CpG島在少數(shù)樣本中發(fā)生部分甲基化。甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)某一位點(diǎn)發(fā)生甲基化時(shí)，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后該位點(diǎn)的胞嘧啶保持不變，若未發(fā)生甲基化則該位點(diǎn)的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?。?jì)算青海地區(qū)漢、撒拉、回族胃癌組織及正常胃組織中NF2基因的甲基化程度，分別為73.3%、70.0%、80.0%；20.0%、15.0%、15.0%。漢、撒拉、回族正常胃組織中NF2基因的甲基化率均高于其正常組織(P<0.001)。(表3)

表3 青海漢族、回族、撒拉族正常胃組織及胃癌組織NF2基因的甲基化率

青海地區(qū)漢、撒拉、回族胃癌組織NF2基因的CpG島甲基化率兩兩比較結(jié)果顯示，上述民族胃癌組織的甲基化率無(wú)顯著差異性(P>0.05)。(表4)提示NF2甲基化與上述民族無(wú)關(guān)，不具有特異性。

表4 青海漢族、回族、撒拉族胃癌組織NF2基因的甲基化率

2.2 青海漢、撒拉、回族胃癌及正常胃組織EZR基因甲基化結(jié)果

亞硫酸氫鹽亞克隆測(cè)序結(jié)果顯示，青海漢、撒拉、回族正常胃組織中的EZR基因未發(fā)生甲基化改變，在胃癌組織中的EZR基因發(fā)生甲基化改變，甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)同前。結(jié)果顯示，與正常胃組織相比，青海漢、撒拉、回族胃癌組織EZR基因甲基化率存在差異(漢族P為0.007，撒拉族為0.033，回族為0.020)。(表5)比較青海漢、撒拉、回族胃癌EZR甲基化率：三者之間沒(méi)有差異性。提示EZR甲基化與青海漢、撒拉、回族無(wú)關(guān)，不具有特異性。(表6)

表5 青海漢族、回族、撒拉族正常胃組織及胃癌組織EZR基因的甲基化率

表6 青海漢族、撒拉族和回族胃癌組織中EZR基因的甲基化率

2.3 青海漢、撒拉、回族胃癌及正常胃組織p53基因甲基化結(jié)果

亞硫酸氫鹽亞克隆測(cè)序結(jié)果顯示，青海漢、撒拉、回族正常胃組織中的p53基因未發(fā)生甲基化改變，胃癌組織中的p53基因發(fā)生甲基化改變，甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)同前。結(jié)果顯示，與正常胃組織相比，青海漢、撒拉和回族胃癌組織中p53基因的甲基化率存在差異(漢族P為0.001，撒拉族為0.020，回族小于0.001)。(表7)比較青海漢、撒拉、回族胃癌p53甲基化率：三者之間沒(méi)有差異性。提示p53的甲基化改變與青海漢、撒拉、回族無(wú)關(guān)，不具有特異性。(表8)

表7 青海漢族、回族、撒拉族正常胃組織及胃癌組織p53基因的甲基化率

表8 青海漢族、撒拉族和回族胃癌組織中p53基因甲基化程度

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素相互作用的過(guò)程，牽涉到環(huán)境因素、遺傳因素和飲食因素等。在分子層面上，胃癌的發(fā)生與抑癌基因p15、p16等的異常表達(dá)或啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化有關(guān)。

基因甲基化是指基因在復(fù)制完成后，在甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)下將S-腺苷甲硫氨酸所攜帶的甲基轉(zhuǎn)移至CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶特定碳原子上的可逆的生物學(xué)過(guò)程[4]。是其合成后的表觀(guān)遺傳學(xué)修飾方式之一，主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列聚集的大小為100～1000 bp左右的CpG島，在機(jī)體內(nèi)以高甲基化、低甲基化和可誘導(dǎo)的去甲基化三種狀態(tài)存在[5]。其中全基因組的低甲基化和部分基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)可改變基因的結(jié)構(gòu)或使其失活，此與腫瘤的發(fā)生相關(guān)[6，7]?；蛟谡＝M織中通常呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)，而在腫瘤組織中則表現(xiàn)出高甲基化或低甲基化狀態(tài)，此與腫瘤的易感性相關(guān)[8]。例如，在卵巢癌、前列腺癌中p15、p16、E-鈣黏素的甲基化程度高于正常組織，提高了機(jī)體對(duì)卵巢癌、前列腺癌的易感性[9，10]；在B淋巴細(xì)胞白血病和結(jié)腸癌中原癌基因KRas和凋亡抑制蛋白Bcl-2呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)[11]。有研究顯示，AREG基因在超過(guò)五分之一的結(jié)腸癌組織中的甲基化率低于正常結(jié)腸組織[12]。

NF2基因又稱(chēng)神經(jīng)纖維瘤Ⅱ型基因，是一個(gè)抑癌基因，可發(fā)生無(wú)義突變、反義突變及剪切點(diǎn)突變，上述突變可使其編碼產(chǎn)物Merlin蛋白變性，進(jìn)而使其喪失腫瘤抑制活性[13，14]。有研究表明，NF2基因突變或缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、室管膜瘤、雙側(cè)前庭神經(jīng)瘤、間皮瘤、黑色素瘤和腎透明細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)生[15-19]。而腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是其發(fā)生突變或缺失的機(jī)制之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、神經(jīng)纖維瘤、室管膜瘤等腫瘤中均存在NF2基因突變或缺失，同時(shí)NF2基因的甲基化與上述腫瘤的發(fā)生也有關(guān)[20-22]。NF2位于22號(hào)染色體，其編碼產(chǎn)物merlin與4.1蛋白家族的其他成員如埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(radxin)、膜突蛋白(moesin)具有相似的結(jié)構(gòu)，不同的是merlin的羧基末端不具有與肌動(dòng)蛋白(F-actin)相結(jié)合的區(qū)域，而在其氨基末端存在與actin結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[23]。此外，merlin蛋白的磷酸化/去磷酸化狀態(tài)，可由p21激活激酶-2(PAK-2)作用于RhoGTPase激酶蛋白家族成員Rac、Cdc42的下游靶蛋白，或PAK-2被生長(zhǎng)因子及其他胞外信號(hào)活化而受到調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架的重組，腫瘤的遷移、侵襲，細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，血管的形成[24]。

EZR基因的編碼產(chǎn)物為ezrin，該蛋白在正常胃、腎臟及腸組織中均有表達(dá)[25]，常定位于細(xì)胞皺褶、細(xì)胞偽足、微絨毛、卵裂溝及收縮環(huán)[26]，與細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞生存、粘附、遷移及侵襲有關(guān)[27]。當(dāng)細(xì)胞粘附、遷移及侵襲能力改變時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[28]。ezrin是最早在雞小腸絨毛上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的ERM蛋白家族成員，可與RhoGTPase蛋白家族成員結(jié)合參與細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖及細(xì)胞骨架重組的調(diào)節(jié)[29，30]。此外，ezrin與粘附分子功能相似，也參與細(xì)胞粘附能力的調(diào)節(jié)，是與腫瘤侵襲相關(guān)的重要因子[31]。

p53基因是管家基因，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮調(diào)控作用[32]；同時(shí)，p53又是一個(gè)抑癌基因，它的缺失、突變或產(chǎn)物蛋白的功能的缺失都與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。此外，p53基因與人類(lèi)50%的腫瘤有關(guān)，其基因甲基化與腫瘤易感有關(guān)[33]。

有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中NF2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度高于正常對(duì)照組，且其甲基化程度與乳腺癌的發(fā)生具有相關(guān)性[20]。在胃癌中發(fā)現(xiàn)EZR基因發(fā)生甲基化改變[27]，其甲基化程度是否與胃癌發(fā)生的易感性相關(guān)，尚未被闡明。p53基因作為廣譜抑癌基因其突變與多種腫瘤相關(guān)，但與NF2的作用機(jī)制是否一致尚不明晰。

綜上所述，青海地區(qū)漢族、撒拉族、回族NF2、EZR和p53基因的甲基化與胃癌易感性有關(guān)，但無(wú)民族差異性。