周欣欣，吳聲敢，王 倬，焦思明，藍(lán) 帥，袁善奎*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

綠色農(nóng)業(yè)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要方向，這對(duì)解決糧食和食品安全問(wèn)題具有重要的戰(zhàn)略意義。通過(guò)激活植物或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)病蟲(chóng)害的免疫防控，可以降低化學(xué)農(nóng)藥的使用，建立起以環(huán)境友好、食品安全為導(dǎo)向的現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)體系。海洋是一個(gè)巨大的生物資源寶庫(kù)，開(kāi)展海洋生物資源的高值化利用已成為各國(guó)發(fā)展海洋經(jīng)濟(jì)的重大舉措。海洋生物普遍具有高蛋白、高碳水化合物和低脂的特點(diǎn)，是多糖、多肽的豐富來(lái)源[1]。海洋生物多糖是海藻多糖、海洋動(dòng)物多糖和海洋微生物多糖的總稱。此類物質(zhì)均含有多聚糖及酸性黏多糖，因其具有多種藥用功能，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2]。其中，酰氨寡糖素（Hetero-chitooligosaccharide）是利用序列精控的生物酶解技術(shù)從海洋生物甲殼類原料中降解得到的特定結(jié)構(gòu)幾丁類寡糖，脫乙酰度在50%～70%，具有更優(yōu)的生物活性及物理化學(xué)性質(zhì)，屬于一種新型免疫誘導(dǎo)劑。植物表面受體與其乙?；鶊F(tuán)結(jié)合可以有效激活植物免疫系統(tǒng)[6-7]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，該類誘導(dǎo)劑可通過(guò)誘導(dǎo)植物與抗蟲(chóng)相關(guān)的基因（如幾丁質(zhì)酶基因、蛋白酶抑制劑基因等）表達(dá)來(lái)提高植物的抗蟲(chóng)能力，代謝產(chǎn)物中與抗蟲(chóng)相關(guān)的物質(zhì)（如單寧、總酚、糖類等）含量均有所增加，以及與抗性相關(guān)的酶活力升高等。同時(shí)，其對(duì)成蟲(chóng)具有產(chǎn)卵驅(qū)避作用，可降低害蟲(chóng)對(duì)作物的為害。

生物農(nóng)藥多為低毒、微毒，對(duì)天敵安全，不傷害蜜蜂、鳥(niǎo)、魚(yú)等環(huán)境有益生物，且對(duì)環(huán)境污染較小。然而，生物農(nóng)藥的種類繁雜，如S-烯蟲(chóng)酯為一種昆蟲(chóng)調(diào)節(jié)劑，屬于生物農(nóng)藥，但對(duì)魚(yú)類、溞類等水生生物的毒性較高，具有致死效應(yīng)[8]。酰氨寡糖素同為生物農(nóng)藥，其市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值巨大，為探索其對(duì)重要水生和陸生環(huán)境非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)和安全風(fēng)險(xiǎn)，本研究選取了4種典型的環(huán)境非靶標(biāo)生物（日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚(yú)和大型溞）為試驗(yàn)對(duì)象，參照GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[9-12]評(píng)估酰氨寡糖素對(duì)上述非靶標(biāo)生物的環(huán)境毒性，旨在為該類產(chǎn)品的安全應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生物。日本鵪鶉（Coturnix japonica），山東省日照市東港區(qū)老孟孵化場(chǎng)；意大利蜜蜂（Apis melliferaL.），浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠；斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio），AB型品系，中科院水生生物研究所；大型溞（Daphnia magna），沈陽(yáng)化工研究院有限公司安全評(píng)價(jià)中心。

供試樣品。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC、7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL，中科榮信（蘇州）生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)條件

各環(huán)境非靶標(biāo)生物毒性試驗(yàn)條件如表1所示。

表1 不同非靶標(biāo)生物的試驗(yàn)條件

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)

根據(jù)GB/T 31270.9—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第9部分：鳥(niǎo)類急性毒性試驗(yàn)》[9]的要求，采用飼喂法開(kāi)展限度試驗(yàn)（或供試物所能配制的最大劑量），同時(shí)設(shè)置空膠囊對(duì)照組（原藥試驗(yàn)）和空白對(duì)照組，各處理組均設(shè)1個(gè)重復(fù)，每組用10只日本鵪鶉（雌雄各5只）。在進(jìn)行95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)每只日本鵪鶉的體重稱量供試物，并裝入膠囊后進(jìn)行灌喂；在進(jìn)行7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL試驗(yàn)時(shí)，將供試物按照1.0 mL/100 g體重，用移液槍經(jīng)口給藥，經(jīng)口灌喂后合并飼養(yǎng)。2 h后，調(diào)查中毒癥狀并按常規(guī)方法喂食。試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組的日本鵪鶉不進(jìn)行任何處理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。試驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)觀察并記錄日本鵪鶉在7 d內(nèi)的中毒癥狀與死亡數(shù)。

表2 鳥(niǎo)類急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)

根據(jù)GB/T 31270.10—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》[10]的要求，采用飼喂法開(kāi)展經(jīng)口限度試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置50%蔗糖水（W/W）對(duì)照組。各處理組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只蜜蜂。在飼喂器（一次性塑料滴管）中加入200 μL試驗(yàn)溶液，對(duì)10只蜜蜂（1個(gè)重復(fù)）進(jìn)行飼喂。暴露結(jié)束后，將飼喂器取出，并測(cè)定每個(gè)蜂籠中試驗(yàn)溶液的消耗量，然后換用不含供試物的蔗糖水進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表3。給藥暴露處理后，觀察并記錄意大利蜜蜂在48 h內(nèi)的中毒癥狀與死亡數(shù)。

表3 蜜蜂急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 魚(yú)類毒性試驗(yàn)

根據(jù)GB/T 31270.12—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第12部分：魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)》[11]的要求，采用半靜態(tài)法開(kāi)展限度試驗(yàn)。48 h后更換試驗(yàn)溶液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照處理，各處理組均設(shè)1個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為10尾斑馬魚(yú)。將供試物用曝氣自來(lái)水經(jīng)超聲助溶30 min后定容，獲得試驗(yàn)溶液（表4）。將配置的試驗(yàn)溶液過(guò)0.45 μm濾膜后，取1.500 kg（約1.50 L，以水密度1.00 g/mL折算）倒入燒杯，用于試驗(yàn)處理。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行，試驗(yàn)期間停止喂食。

表4 魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)溶液配制表

1.3.4 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)

根據(jù)GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第13部分：溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)》[12]的要求，采用靜態(tài)法開(kāi)展限度試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，各處理組均設(shè)4個(gè)重復(fù)，并同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。將供試物用適量試驗(yàn)用水經(jīng)超聲助溶30 min后定容，獲得試驗(yàn)溶液（表5）。將配置的試驗(yàn)溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，取50.0 mL加入到60 mm×3.8 mm（直徑×高）的結(jié)晶皿中，然后用滴管加入大型溞，每皿5只，蓋上皿蓋后，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始后，定時(shí)觀察并記錄大型溞48 h內(nèi)的受抑制數(shù)和中毒癥狀。試驗(yàn)期間，對(duì)試驗(yàn)體系不進(jìn)行喂食。

表5 蟤類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)溶液配制表

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)均為限度試驗(yàn)。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)置劑量（濃度）及其對(duì)應(yīng)的非靶標(biāo)生物死亡數(shù)來(lái)估算LD50、LC50和EC50值，并以此評(píng)估酰氨寡糖素對(duì)不同生物的急性毒性效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對(duì)照組的日本鵪鶉均未出現(xiàn)死亡，死亡率為0，且各處理組的日本鵪鶉均表現(xiàn)正常，表明在最大限度劑量下，其對(duì)日本鵪鶉無(wú)致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)日本鵪鶉的7 d-LD50值分別為＞2.24×103mg a.i./kg和＞762.6 mg a.i./kg。參考GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)日本鵪鶉低毒。

2.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對(duì)照組的蜜蜂均未出現(xiàn)死亡，死亡率為0，且各處理組的蜜蜂均表現(xiàn)正常，表明在最大限度劑量下，其對(duì)意大利蜜蜂無(wú)致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)意大利蜜蜂的48 h-LD50值分別為＞130 μg a.i./蜂和＞118 μg a.i./蜂。參考GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)蜜蜂低毒。

2.3 魚(yú)類毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對(duì)照組的斑馬魚(yú)均未出現(xiàn)中毒癥狀，死亡率為0，表明在最大限度濃度下，其對(duì)斑馬魚(yú)無(wú)致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)斑馬魚(yú)的96 h-LC50值分別為＞168 mg a.i./L和＞150 mg a.i./L。參考GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)斑馬魚(yú)低毒。

2.4 蟤類活動(dòng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對(duì)照組的大型溞均未出現(xiàn)中毒癥狀，活動(dòng)抑制率為0，表明在最大限度濃度下，其對(duì)大型溞無(wú)致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)大型溞的48 h-EC50值分別為＞224 mg a.i./L和＞152 mg a.i./L。參考GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)大型溞低毒。

3 結(jié)論與討論

本研究選取了4種典型的環(huán)境非靶標(biāo)生物，評(píng)估了95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)生物的急性毒性。研究發(fā)現(xiàn)，上述供試物在限度試驗(yàn)條件下對(duì)日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚(yú)、大型溞均無(wú)致死毒性，表明此類產(chǎn)品對(duì)環(huán)境有益生物安全。

近年來(lái)，我國(guó)植物免疫誘導(dǎo)劑已有較大發(fā)展，蛋白激發(fā)子、寡糖、脫落酸、枯草桿菌及木霉作為一種新型的多功能生物農(nóng)藥產(chǎn)品，在我國(guó)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)農(nóng)藥不同，這些植物免疫誘導(dǎo)劑的共同特點(diǎn)是能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病蟲(chóng)性，且不直接殺死病原菌[13]。研究表明，低脫乙酰度的幾丁類寡糖對(duì)植物的誘導(dǎo)活性比傳統(tǒng)殼寡糖產(chǎn)品更強(qiáng)，因此已成為最新的研究方向。根據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)匯總，已有106個(gè)氨基寡糖素（脫乙酰度＞70%）農(nóng)藥產(chǎn)品取得正式登記并用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。然而，脫乙酰度在50%～70%的酰氨寡糖素中僅有7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL于2021年在甘藍(lán)小菜蛾上獲得登記。該產(chǎn)品對(duì)防治對(duì)象沒(méi)有直接毒性，通過(guò)誘導(dǎo)植物對(duì)有害生物的侵染產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，以此提高植物的抗性。目前，國(guó)內(nèi)外尚未建立該類生物農(nóng)藥的環(huán)境安全性試驗(yàn)準(zhǔn)則，本研究?jī)H參照化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法開(kāi)展了酰氨寡糖素醋酸鹽對(duì)4種典型環(huán)境生物的急性毒性試驗(yàn)。此外，圍繞該類生物農(nóng)藥的環(huán)境生物安全評(píng)價(jià)研究較少。根據(jù)《農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》[14]程序，在初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估較低（急性毒性試驗(yàn)無(wú)危害）的情況下，不要求進(jìn)行高級(jí)階段試驗(yàn)（慢性毒性試驗(yàn)）。本研究中，由于95%氨基寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對(duì)4種典型非靶標(biāo)生物日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚(yú)及大型溞均為低毒，故未開(kāi)展慢性試驗(yàn)。今后，我們還應(yīng)結(jié)合該類化合物的特性，優(yōu)化試驗(yàn)方法，關(guān)注更多種類的非靶標(biāo)生物并評(píng)估其慢性毒性，進(jìn)一步研究和監(jiān)測(cè)其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。