任元元，李宇航，孟資寬，張?chǎng)?，鄒育，王擁軍

(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川 成都，611130)

鮮濕米粉是我國(guó)的一種傳統(tǒng)食物，距今已有幾千年的歷史[1]?，F(xiàn)在生產(chǎn)米粉的作坊和小廠多為自然發(fā)酵，經(jīng)過自然發(fā)酵的米粉，比未發(fā)酵過的米粉食用品質(zhì)更佳[2]。但自然發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，一般為2～3 d，容易被環(huán)境影響而導(dǎo)致雜菌污染，不能控制產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性[3]。微生物強(qiáng)化發(fā)酵成為目前受歡迎的發(fā)酵方式，馬霞等[4]從大米發(fā)酵液中分離鑒定出乳酸乳球菌，利用其發(fā)酵米粉后品質(zhì)明顯提高；李蕓等[5]采用從米粉中分離的4株優(yōu)勢(shì)菌混合發(fā)酵，米粉品質(zhì)最接近于自然發(fā)酵。微生物強(qiáng)化發(fā)酵可加快發(fā)酵速度，提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性[6]。

米粉發(fā)酵液中起主要作用的是乳酸菌[7]。楊有望[8]通過對(duì)大米自然發(fā)酵液高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，各個(gè)階段乳酸菌的含量占整個(gè)細(xì)菌含量的90%以上，植物乳桿菌屬是鮮濕米粉自然發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌。樊振南等[9]利用3種不同的植物乳桿菌分別強(qiáng)化發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)鮮濕米粉的品質(zhì)都有一定程度地提升，風(fēng)味也呈現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)特征。目前，關(guān)于不同種類乳酸菌、乳酸菌協(xié)同酵母菌發(fā)酵鮮濕米粉的研究較少，有學(xué)者以植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母3種微生物純種發(fā)酵米粉，研究了其對(duì)食用品質(zhì)的影響[10]，而植物乳桿菌、釀酒酵母和干酪乳桿菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)鮮濕米粉風(fēng)味的研究未見報(bào)道。本研究利用這3種菌協(xié)同發(fā)酵鮮濕米粉，并測(cè)定產(chǎn)酸能力、植物乳桿菌活菌數(shù)、理化性質(zhì)、蒸煮特性、質(zhì)構(gòu)特性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，研究協(xié)同發(fā)酵對(duì)鮮濕米粉品質(zhì)特性和風(fēng)味的影響，對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)多種微生物在鮮濕米粉產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

早秈米，廣漢市鑫發(fā)農(nóng)副產(chǎn)品有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum.9，L.p.9)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae.23,S.c.23)，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei.17,L.c.17)，由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選于自然米粉發(fā)酵液；其余試劑均為分析純，成都市科龍化學(xué)品有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DM-140型磨粉磨漿機(jī)，上海雙億機(jī)電有限公司；SZ-30型米粉機(jī)，廣州旭眾有限公司；TA-XT型質(zhì)構(gòu)儀，上海騰拔科技有限公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮮濕米粉的制備

參照席慧婷等[11]的方法，鮮濕米粉的制備工藝：原料→清洗→磨漿→發(fā)酵→糊化擠壓→冷凍老化→水洗→包裝。工藝要點(diǎn)：稱取10 kg大米，清洗米粒3遍，加入8 kg蒸餾水后打漿。分別稱取3 kg的米漿，放在紫外燈下滅菌，發(fā)酵過程共分為4組，分別接入L.p.9；L.p.9+S.c.23；L.p.9+L.c.17；L.p.9+S.c.23和L.c.17。各實(shí)驗(yàn)組菌液初始濃度用磷酸鹽緩沖液稀釋到1×109CFU/mL。對(duì)照為自然發(fā)酵組，將各實(shí)驗(yàn)組于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵12 h。

1.2.2 產(chǎn)酸能力的測(cè)定和微生物計(jì)數(shù)

取各組樣品中發(fā)酵米漿的溶液，每3 h取1次，用pH計(jì)測(cè)量。在3、6、9、12 h分別取發(fā)酵米漿樣品，采用稀釋法，使用乳酸菌MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)48～72 h后計(jì)數(shù)。

1.2.3 理化性質(zhì)的測(cè)定

直鏈淀粉含量參照GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量參照GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪含量參照GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》。

1.2.4 蒸煮特性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]的方法：取發(fā)酵12 h的10 g左右鮮濕米粉(m0)，加入300 mL沸水煮3 min，瀝干5 min，稱質(zhì)量得m1。蒸煮液于105 ℃下干燥至恒重，稱量得水中固形物m2。蒸煮損失率和復(fù)水率的計(jì)算如公式(1)(2)所示：

(1)

(2)

1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

取發(fā)酵12 h的鮮濕米粉測(cè)量。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)[13]：測(cè)定模式TPA；測(cè)定探頭，TA 3/100；下行速度1 mm/s；測(cè)定速度0.5 mm/s；上行速度1 mm/s；測(cè)試距離20 mm；應(yīng)變位移50%；引發(fā)力5 g；引發(fā)類型，自動(dòng)；獲取數(shù)率200 PPS。質(zhì)構(gòu)TPA指標(biāo)包括硬度、彈性、咀嚼性、回復(fù)性和黏聚性。

1.2.6 揮發(fā)性成分測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS 25.0和Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH的變化

乳酸菌作為米粉發(fā)酵過程中的主要微生物，能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，降低發(fā)酵液的pH并抑制有害微生物的生長(zhǎng)[14]。如圖1所示，不同發(fā)酵方式產(chǎn)酸能力差異顯著(P<0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，pH不斷降低，發(fā)酵開始到9 h pH下降最明顯，在12 h時(shí)除了自然發(fā)酵組外，各組的pH均在4.5以下，其中L.p.9+S.c.23+L.c.17產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，達(dá)到(4.02±0.10)。3個(gè)協(xié)同發(fā)酵組pH下降趨勢(shì)和L.p.9的趨勢(shì)一致，并且協(xié)同發(fā)酵組的pH值要低于L.p.9，說明植物乳桿菌在發(fā)酵初期就成為主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)菌，并且在不同菌種協(xié)同作用下酸度更低。酸度下降最慢的是自然發(fā)酵組，是因?yàn)榄h(huán)境中的多種微生物相互競(jìng)爭(zhēng)和作用，包括霉菌等參與發(fā)酵，這與李蕓等[5]的研究結(jié)果相似。

圖1 發(fā)酵過程pH的變化Fig.1 Change of pH during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中植物乳桿菌活菌數(shù)的變化

如圖2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，植物乳桿菌活菌數(shù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在發(fā)酵3 h，植物乳桿菌活菌數(shù)快速增長(zhǎng)，在9 h增長(zhǎng)速度趨于平緩，此時(shí)L.p.9+S.c.23+L.c.17組植物乳桿菌活菌數(shù)最高，為(9.06±0.15) lg CFU/g，自然發(fā)酵組植物乳桿菌的活菌數(shù)最低。單一植物乳桿菌發(fā)酵組的活菌數(shù)低于3組協(xié)同發(fā)酵組，說明協(xié)同發(fā)酵能夠促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，這是因?yàn)橹参锶闂U菌蛋白水解系統(tǒng)不完全，對(duì)大米中蛋白質(zhì)含量減少作用不明顯，而干酪乳桿菌蛋白酶活力強(qiáng)，能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多肽和氨基酸為植物乳桿菌提

圖2 植物乳桿菌活菌數(shù)的變化Fig.2 Changes of viable number of L.plantarum

供氮源，促進(jìn)其生長(zhǎng)[15]；酵母菌也能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和維生素為植物乳桿菌提供營(yíng)養(yǎng)，乳酸菌產(chǎn)酸為酵母菌生長(zhǎng)提供良好的酸性環(huán)境，相互促進(jìn)的共生關(guān)系使得植物乳桿菌作用更強(qiáng)[16]。協(xié)同發(fā)酵明顯促進(jìn)了植物乳桿菌在發(fā)酵液中的生長(zhǎng)，活菌數(shù)顯著高于單一植物乳桿菌發(fā)酵。

2.3 協(xié)同發(fā)酵對(duì)直鏈淀粉的影響

如圖3所示，經(jīng)過發(fā)酵各組大米直鏈淀粉含量均有所增長(zhǎng)，其中L.p.9+S.c.23+L.c.17組直鏈淀粉增加了24.3%，增長(zhǎng)比例最大，自然發(fā)酵組增長(zhǎng)比例最小。L.p.9+S.c.23組和S.c.23+L.c.17組直鏈淀粉含量增加差異不顯著(P>0.05)。單一植物乳桿菌發(fā)酵組直鏈淀粉增長(zhǎng)的相對(duì)比例均小于協(xié)同發(fā)酵組。淀粉的非結(jié)晶區(qū)主要是由直鏈淀粉構(gòu)成，發(fā)酵中微生物產(chǎn)生的酸和酶會(huì)水解支鏈淀粉，降解淀粉顆粒，提高結(jié)晶度，增加非結(jié)晶區(qū)的比例，所以發(fā)酵后的大米直鏈淀粉含量增加，并且協(xié)同發(fā)酵優(yōu)勢(shì)微生物越多，產(chǎn)生的酸和酶也越多，支鏈淀粉水解作用更強(qiáng)，直鏈淀粉含量增加越明顯[17]。

圖3 直鏈淀粉含量的變化Fig.3 Change of amylose content

2.4 協(xié)同發(fā)酵對(duì)蛋白質(zhì)的影響

如圖4所示，發(fā)酵顯著降低了大米中蛋白質(zhì)的含量。自然發(fā)酵組的蛋白質(zhì)含量下降最少，由8.05%下降到6.49%。3個(gè)協(xié)同發(fā)酵組蛋白質(zhì)含量下降比例顯著高于單一植物乳桿菌組，其中L.p.9+S.c.23+L.c.17組由8.05%下降到5.09%，下降相對(duì)比例最高為36.77%。L.p.9+S.c.23組蛋白質(zhì)降低的比例低于L.p.9+L.c.17組，可能是酵母菌的蛋白酶活力較弱，分解蛋白質(zhì)能力不強(qiáng)，主要起分解作用的是乳酸菌產(chǎn)酸的蛋白酶[18]。雖然從營(yíng)養(yǎng)方面，協(xié)同發(fā)酵降低了一定的蛋白質(zhì)含量，但是卻起到了純化淀粉，增強(qiáng)淀粉凝膠能力的作用，此外，蛋白質(zhì)分解而成的游離氨基酸也參與風(fēng)味物質(zhì)的形成[19]。

圖4 蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of protein content

2.5 協(xié)同發(fā)酵對(duì)脂肪的影響

如圖5所示，發(fā)酵顯著降低了大米中脂肪的含量。植物乳桿菌L.p.9組脂肪含量下降比例最少，從1.3%到0.74%。協(xié)同發(fā)酵組與自然發(fā)酵組脂肪下降幅度均高于L.p.9組，其中，L.p.9+S.c.23+L.c.17組脂肪下降到最低，為0.52%。自然發(fā)酵組消耗脂肪的能力要強(qiáng)于L.p.9+S.c.23組和L.p.9+L.c.17組，原因是自然發(fā)酵存在多種微生物，而霉菌和細(xì)菌有較強(qiáng)產(chǎn)脂肪酸的能力，所以自然發(fā)酵分解脂肪效率更高[10]。L.p.9+L.c.17組消耗脂肪的能力強(qiáng)于L.p.9+S.c.23組，這可能是因?yàn)楦衫胰闂U菌作為腸道益生菌，具有高效分解脂肪的能力[20]。協(xié)同發(fā)酵有利于脂肪的降解，也利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[21]。

圖5 脂肪含量的變化Fig.5 Change of fat content

2.6 協(xié)同發(fā)酵對(duì)米粉蒸煮特性的影響

如表1所示，自然發(fā)酵組的米粉蒸煮損失率顯著高于L.p.9(P<0.05)，復(fù)水率顯著低于L.p.9(P<0.05)。L.p.9組的米粉蒸煮損失率顯著高于3個(gè)協(xié)同發(fā)酵組(P<0.05)，復(fù)水率顯著低于3個(gè)協(xié)同發(fā)酵組(P<0.05)。經(jīng)過多種微生物協(xié)同發(fā)酵的米粉更耐煮，不渾湯，這可能是發(fā)酵改變了米粉顆粒和淀粉結(jié)構(gòu)，米粉顆粒減小更易糊化，復(fù)水力增加，淀粉結(jié)構(gòu)中支鏈淀粉含量下降，形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，蒸煮損失率降低[22]。

表1 發(fā)酵對(duì)米粉蒸煮特性的影響Table 1 Effect of fermentation on cooking characteristics of rice noodles

2.7 協(xié)同發(fā)酵對(duì)米粉質(zhì)構(gòu)的影響

如表2所示，除L.p.9+S.c.23和L.p.9+L.c.17組黏彈性差異不顯著外，米粉各質(zhì)構(gòu)指標(biāo)變化差異顯著(P<0.05)。L.p.9組在5種質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)上均優(yōu)于自然發(fā)酵組，說明植物乳桿菌發(fā)酵改善了米粉的品質(zhì)，這與周顯青等[23]的結(jié)論一致。L.p.9+S.c.23+L.c.17組質(zhì)構(gòu)特性品質(zhì)最高，說明多種微生物協(xié)同作用提高了米粉的硬度和彈性，改善了黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性。L.p.9+L.c.17組干酪乳桿菌協(xié)同發(fā)酵在硬度、咀嚼性和回復(fù)性上均高于L.p.9+S.c.23組。這可能是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸，乳酸菌和酵母菌產(chǎn)生的酶直接作用于淀粉分子結(jié)構(gòu)，使直鏈淀粉分子斷鏈及脫支，減弱其再結(jié)晶能力，保持凝膠水分，發(fā)酵也增強(qiáng)了直鏈淀粉的聚合度，形成較強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些變化有利于米粉糊化和老化，增強(qiáng)米粉的質(zhì)構(gòu)特性[24]。

表2 發(fā)酵對(duì)米粉質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effect of fermentation on texture of rice noodles

2.8 協(xié)同發(fā)酵對(duì)米粉風(fēng)味的影響

由表3可知，L.p.9組檢測(cè)出的香氣成分有25種，其中以己醛和十一醛為代表的醛類化合物含量最多，占37.13%；以丙二酸和乙酸為代表的酸類化合物其次，占21.63%。L.p.9+S.c.23組檢測(cè)出的香氣成分有31種，其中以乙酸乙酯和己酸乙酯為代表的酯類化合物含量最多，占31.42%；以苯乙醇為代表的醇類化合物其次，占31.21%。L.p.9+L.c.17組檢測(cè)出的香氣成分有28種，其中以己醛和壬醛為代表的醛類化合物含量最多，占38.7%；以丙酸和丙二酸為代表的酸類化合物其次，占25.43%。L.p.9+S.c.23+L.c.17組檢測(cè)出的香氣成分有38種，其中以乙酸乙酯和乳酸丁酯為代表的酯類化合物含量最多，占46.17%，以癸醇和苯乙醇為代表的醇類化合物其次，占25.46%。自然發(fā)酵組檢測(cè)出的香氣成分有29種，其中以丁酸辛酯和丁酸丁酯為代表的酯類化合物含量最多，占34%；以1-壬烯-3-醇和苯乙醇為代表的醇類化合物其次，占27.64%。

表3 協(xié)同發(fā)酵的米粉香氣成分分析結(jié)果Table 3 Analysis results of aroma components of rice noodles by co-fermentation

續(xù)表3

發(fā)酵米粉的揮發(fā)性成分包括醛、醇、酸、酯、烴類化合物，自然發(fā)酵的米粉中香氣成分以酯類和醇類為主。醛類和酸類物質(zhì)也是乳酸菌發(fā)酵米粉中主要揮發(fā)性氣味。酯類物質(zhì)是酵母菌和乳酸菌協(xié)同發(fā)酵米粉中的主要揮發(fā)性氣味。醇類物質(zhì)在酵母菌的協(xié)同作用下也變成了主要香氣成分，檢測(cè)出的苯乙醇在酵母菌和植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵時(shí)含量最高。酵母菌的加入使得米粉在風(fēng)味物質(zhì)上生成更多酯類、醇類香氣物質(zhì)，可能是酵母發(fā)酵主要產(chǎn)物是酒精和CO2，還有其他醇類，酒精與乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸生成酯，對(duì)米粉的香氣有著重要的貢獻(xiàn)[25]。乳酸菌主要影響鮮濕米粉的品質(zhì)特性，酵母菌主要影響其風(fēng)味成分，這與易翠平等[26]結(jié)論一致。

3 結(jié)論

本研究將篩選得到的干酪乳桿菌、釀酒酵母菌與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，并對(duì)產(chǎn)酸能力、植物乳桿菌活菌數(shù)、理化性質(zhì)、蒸煮特性、質(zhì)構(gòu)特性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵米粉品質(zhì)良好，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)顯著增加。其中L.p.9+S.c.23+L.c.17產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，植物乳桿菌活菌數(shù)最高，達(dá)到(9.06±0.15) lg CFU/g。在降低蛋白質(zhì)、脂肪含量，提高直鏈淀粉含量方面優(yōu)于其他組，在蒸煮特性和質(zhì)構(gòu)特性上也是發(fā)酵組中最佳。L.p.9+S.c.23+L.c.17共檢測(cè)出38種揮發(fā)性風(fēng)味成分，種類最多，主要呈味物質(zhì)為酯類和醇類。因此，多菌種協(xié)同發(fā)酵得到的米粉品質(zhì)和風(fēng)味良好，有利于微生物菌劑的開發(fā)和在米粉產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用。