王溢，蘇晨露，艾連中，丁軍，賴(lài)?guó)P羲*，陳佳琪，宋子波

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093) 2(云南貓哆哩集團(tuán)食品有限責(zé)任公司，云南 玉溪，653100)

滇橄欖(PhyllanthusemblicaLinn.)又稱(chēng)余甘子、印度醋栗、庵摩勒等，是大戟科葉下珠屬的藥食同源植物[1]；其新鮮果實(shí)口感清脆，初嘗酸澀但回甘生津，風(fēng)味獨(dú)特。滇橄欖具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、降血脂、降膽固醇、降血糖、降血壓、改善記憶、延緩衰老等多種功效，這些功效與滇橄欖果肉中豐富的酚類(lèi)化合物、維生素C、碳水化合物及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)[2-4]。

即飲功能性還原果汁是熱門(mén)的飲料產(chǎn)品，滇橄欖果汁含有豐富的抗氧化多酚及維生素C，具有開(kāi)發(fā)為功能性即飲果汁的潛力。工業(yè)上濃縮果汁的制作過(guò)程是將果實(shí)壓榨、殺青、濃縮、包裝、貯藏、運(yùn)輸，在商店稀釋還原成即飲果汁供消費(fèi)。滇橄欖果汁殺青后在冷凍貯藏過(guò)程中相當(dāng)穩(wěn)定，但在還原成即飲果汁供應(yīng)消費(fèi)的短期貯藏過(guò)程中并不穩(wěn)定，容易發(fā)生沉淀及褐變現(xiàn)象，其沉淀現(xiàn)象可能與特定多酚(如單寧)、特定有機(jī)酸或蛋白質(zhì)等組成[5-7]有關(guān)；其褐變主要為非酶褐變，在低溫或常溫貯藏的情況下，主要為多酚化學(xué)性的氧化縮合反應(yīng)[8-9]和維生素C降解反應(yīng)[10]，產(chǎn)生褐色副產(chǎn)物5-羥甲基糠醛或糖類(lèi)-蛋白質(zhì)反應(yīng)的美拉德產(chǎn)物。

控制殺青后的滇橄欖還原果汁的短期貯藏過(guò)程中的褐變及沉淀現(xiàn)象是相當(dāng)重要的研究主題，采取低成本、可行性高且多重工藝組合是必然的策略。對(duì)富含多酚的果汁飲料而言，降低褐變或沉淀的工藝單元操作包括：沉淀劑處理、冷沉淀處理、酶(例如果膠酶、蛋白酶和單寧酶)處理等[7,11-12]，然而目前尚未見(jiàn)有效控制滇橄欖還原果汁的褐變與沉淀的多重工藝流程的研究報(bào)告，更未見(jiàn)完整解析控制其褐變的機(jī)理和關(guān)鍵多酚組成的相關(guān)文獻(xiàn)。

因此，本研究目的在探討降低褐變程度的復(fù)合工藝技術(shù)(包括酶、沉淀劑、冷沉淀預(yù)處理和冷藏等)，以褐變動(dòng)力學(xué)解析去沉淀處理后果汁的褐變速率和半數(shù)貯藏時(shí)間，并結(jié)合高效液相色譜分析法(HPLC)及統(tǒng)計(jì)學(xué)上主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)，系統(tǒng)性闡明控制該果汁褐變的機(jī)理與關(guān)鍵多酚組成分。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

材料：滇橄欖果汁濃縮汁(已經(jīng)殺青不活化多酚氧化酶)，云南貓哆哩集團(tuán)食品有限責(zé)任公司；果膠酶(S10007，CAS#9032-75-1，500 U/mg)、單寧酶(S10207，CAS#9025-71-2，200 U/g)、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、鞣料云實(shí)素，上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(CAS#9001-73-4，>6 000 U/mg)，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；CaCl2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，上?；瘜W(xué)泰坦有限公司；甲醇，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

設(shè)備：JXN-26離心機(jī)，BECKMAN COULTER公司；752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；CR-400色差儀，KONICA公司；Waters e2695高效液相色譜，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滇橄欖還原果汁的制備

將濃縮果汁稀釋3倍制備成還原果汁，將還原果汁分裝，進(jìn)行下列4種工藝流程，如圖1所示。

圖1 滇橄欖還原果汁的不同前處理工藝與貯藏條件的流程Fig.1 Flow charts for various treatments and storage conditions of restored juice from Phyllanthus emblica Linn.fruit 注：“+” 表示添加；“-” 表示未添加

流程Ⅰ為空白組，還原果汁加或不加沉淀劑(0.05% CaCl2)3 h后，離心(6 000 r/min，10 min)，取上清液進(jìn)行抽濾(定性濾紙102號(hào))，所得濾液裝入螺蓋玻璃試管中(50 mL/管)密封，分兩組在4 ℃冰箱或室溫下貯藏。流程Ⅱ?yàn)樘砑訂我幻福踊虿患映恋韯┨幚斫M，即還原汁每管先加一種酶(0.01% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)；即果膠酶50 U/g、蛋白酶>600 U/g、單寧酶0.02 U/g)，而后加或不加沉淀劑處理3小時(shí)后，離心、過(guò)濾及貯藏(同流程Ⅰ)。流程Ⅲ為添加單一酶，加或不加沉淀劑，均進(jìn)行冷沉淀處理組，即在流程Ⅱ的基礎(chǔ)上，沉淀劑處理之后、離心之前進(jìn)行冷藏促進(jìn)沉淀(4 ℃、72 h)并離心去除沉淀物。流程Ⅳ為加復(fù)合酶，加維生素C，加或不加沉淀劑，均進(jìn)行冷沉淀處理組，即在流程Ⅲ的基礎(chǔ)上，冷沉淀之前加維生素C(0.01%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，貯藏時(shí)采用4 ℃、室溫(25 ℃)和37 ℃ 3種；復(fù)合酶為果膠酶/蛋白酶、果膠酶/單寧酶、蛋白酶/單寧酶或果膠酶/蛋白酶/單寧酶，各種酶的活性同流程I。各流程的各組均兩組平行制備與測(cè)定。

1.2.2 褐色指標(biāo)的測(cè)定

將滇橄欖果汁1 mL以去離子水稀釋5倍之后，于420 nm處的測(cè)定吸光度(A420)，A420反映褐變程度，簡(jiǎn)稱(chēng)為褐色指標(biāo)[5,13]。

1.2.3 褐變速率的計(jì)算

殺青后的果汁和貯藏過(guò)程中的多酚產(chǎn)生化學(xué)性氧化褐變反應(yīng)[14]、維生素C的降解與美拉德反應(yīng)引起的褐變[15-18]皆呈一級(jí)反應(yīng)模型，即褐變產(chǎn)物的生成速率為反應(yīng)物濃度的一級(jí)反應(yīng)，如方程式(1)[19]所示。

(1)

式中：Ct，t時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)物濃度；k，反應(yīng)速率常數(shù)，d-1，與溫度有關(guān)。因此合理地假設(shè)富含多酚、維生素C與糖類(lèi)的滇橄欖還原果汁在短期保藏下的初期褐變現(xiàn)象為一級(jí)反應(yīng)，褐變中間反應(yīng)物即為中間產(chǎn)物，而且在適當(dāng)?shù)蜐舛认?，褐色指?biāo)(A420)與褐色物質(zhì)濃度呈正比[20]。因此可將A420代替濃度代入方程式(1)，簡(jiǎn)化并重整得方程式(2)～(3)[19,21]。將kB代入方程式(4)可求得半褐變時(shí)間(t1/2)，d。

(2)

(3)

t1/2=ln2/kB

(4)

式中：A0、At,0和td的褐變值；kB，以褐變值為指標(biāo)的反應(yīng)速率常數(shù)，d-1，即ln(At/A0)對(duì)時(shí)間t作圖的斜率；t1/2，半褐變時(shí)間，d。動(dòng)力學(xué)分析的數(shù)據(jù)為4次平行測(cè)定的結(jié)果，以減少操作和環(huán)境誤差。

1.2.4 色差值的測(cè)定

將滇橄欖果汁1 mL以去離子水稀釋5倍之后，取樣品溶液5 mL于色差儀CR-400中測(cè)量CIE色值(L*,a*,b*), 校正白板色度為L(zhǎng)=95.22；a=-0.48；b=3.50；測(cè)定溫度為室溫。

1.2.5 多酚組成的分析

采用HPLC進(jìn)行鑒定，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.4%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，色譜柱Waters XSelect CSH C18(4.6 mm×150 mm×3.5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.35 mL/min。梯度洗脫條件：0～6 min，0%～7% B；6～26 min，7%～30% B；26～51 min，30%～80% B；51～60 min，80%～90% B。以Empower軟件進(jìn)行圖譜處理。滇橄欖原汁取上清液，加體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇稀釋100倍后進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯和鞣料云實(shí)素分別配制為10～250、10～18和10～200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。平行測(cè)定3次。所得制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：沒(méi)食子酸Y=81 888X-283 060，R2= 0.999；沒(méi)食子酸甲酯Y=86 756X-124 285，R2=1.000；鞣料云實(shí)素Y=56 540X-319 305，R2=0.996，其中X為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(μg/mL)，Y為峰面積。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與繪圖

利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)平均、線性回歸分析，求得反應(yīng)速率常數(shù)和級(jí)數(shù)。SPSS 25中的ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用Origin pro 8.0進(jìn)行繪圖和聚類(lèi)分析。采用SIMCA 14.1進(jìn)行PCA和OPLS-DA。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一酶、沉淀劑、預(yù)冷沉淀處理與貯藏溫度對(duì)滇橄欖還原汁的沉淀與色澤的影響

表1顯示工藝流程I、II和III所探討的工藝因素(酶、沉淀劑、冷沉淀)以及貯藏溫度對(duì)還原果汁沉淀與色澤的影響，特別觀察貯藏8～24 d的現(xiàn)象。在無(wú)冷沉淀處理下：4 ℃保藏組(第1～8組)在保藏24 d時(shí)仍維持原汁的澄清金黃色，L*值為82.97～86.08、a*為-2.26～-1.37、b*為23.98～29.05、褐色指標(biāo)(A420)為0.573～0.686；有沉淀劑(0.05% CaCl2)組比無(wú)沉淀劑組產(chǎn)生明顯較多的沉淀量；且果膠酶和蛋白酶組，加沉淀劑比不加沉淀劑具有較低的b*值與褐色指標(biāo)。無(wú)冷沉淀處理的室溫保藏組(第9～16組)，保藏24 d后的果汁呈黃銅色，L*值為54.19～77.03、a*值為0.81～5.52、b*值為37.42～44.35，褐色指標(biāo)高達(dá)1.683～≥3.000。果膠酶和蛋白酶處理組(除第12組外)的褐色指標(biāo)低于空白組；單寧酶處理組比其他組具有明顯多的沉淀量、較深的褐色(較低L*值、較高a*和b*值)以及極高的褐色指標(biāo)。當(dāng)加上冷沉淀(4 ℃、72 h) 處理并去除沉淀物后的室溫保藏組(第17～24組)，保藏到第8天的沉淀量大部分都高于沒(méi)有冷沉淀的室溫保藏組(第9～16組，但第20和24組除外)，色澤呈金黃色，L*、a*與b*值介于無(wú)冷沉淀處理的4 ℃和室溫保藏組之間。相較于上述沒(méi)有冷沉淀處理的室溫保藏組，冷沉淀處理可使大部分組(第17、20、22～24組)的褐色指標(biāo)明顯地降低。且對(duì)于果膠酶和蛋白酶組，加沉淀劑比不加沉淀劑呈現(xiàn)了較低的b*值與褐色指標(biāo)。

表1 沉淀劑、酶、冷沉淀以及貯藏溫度對(duì)滇澉欖還原果汁的沉淀程度、色差值及褐色指標(biāo)1的影響Table 1 Effects of precipitants, single enzymes, cold-precipitation, and storage temperature on the precipitation, colorimetric parameters, and browning index of restored juice from P. emblica fruit

續(xù)表1

將表1結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2所示，其中1～8組可分為一大類(lèi)，保藏溫度均為4 ℃；15、16組為一大類(lèi)，均添加單寧酶、無(wú)冷沉淀且室溫保藏，有無(wú)添加沉淀劑不影響分類(lèi)，即沉淀劑的作用不顯著；其他組為一大類(lèi)，保藏溫度皆為室溫，并可細(xì)分為9～14和23～24組小類(lèi)以及17～22組小類(lèi)。此聚類(lèi)分析結(jié)果說(shuō)明，影響滇橄欖汁還原果汁色澤與褐變的工藝操作的重要性是：保藏溫度>冷沉淀和單寧酶處理>沉淀劑處理。果膠酶或蛋白酶處理須配合4 ℃保藏才有控制褐變的效果；添加單寧酶反而促進(jìn)褐變和沉淀，不宜采用。冷沉淀配合離心去沉淀的處理有利于降低褐變。沉淀劑(0.05% CaCl2)的添加只對(duì)冷藏時(shí)的沉淀作用有促進(jìn)效果，但對(duì)色澤無(wú)明顯影響。

圖2 不同工藝流程處理的滇橄欖還原果汁的聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster analysis of various restored juices from P. emblica fruit subjected to various processes

2.2 復(fù)合酶、冷沉淀處理與貯藏溫度多重條件對(duì)滇橄欖還原果汁沉淀與色澤的影響

澄清工藝流程IV綜合探討添加復(fù)合酶與維生素C(0.01%)、冷沉淀處理和保藏溫度對(duì)滇橄欖汁在短期保藏過(guò)程中沉淀與褐色指標(biāo)的影響。表2顯示4種復(fù)合酶組在沒(méi)有冷沉淀并離心去沉淀處理時(shí)(第C1～C4組)，保藏后仍有明顯的沉淀現(xiàn)象，褐色指標(biāo)為0.121～0.125 (4 ℃保藏)，0.192～0.245(25 ℃保藏)或0.528～0.576 (37 ℃保藏)。而冷沉淀并離心去沉淀處理時(shí)(第C5～C8組)，保藏期的沉淀程度明顯減少，且25和37 ℃保藏組的褐色指標(biāo)亦明顯低于無(wú)冷沉淀處理組。

表2 復(fù)合酶與維生素C并冷沉淀處理對(duì)滇橄欖還原果汁在14 d保藏后沉淀與褐色指標(biāo)的影響Table 2 Effects of multiple enzymes, vitamin C, and cold-precipitation treatments on the precipitation and browning index of restored juice from P. emblica fruit after 14-day storage

表3顯示所有4 ℃保藏組的L*，a*和b*值變化范圍分別為85.2～88.1,-1.89～-0.90和22.0～25.0；所有25 ℃保藏組的L*，a*和b*值變化范圍分別為80.1～86.5,-1.50～0.07和26.1～36.2；而所有37 ℃保藏組的L*，a*和b*值變化范圍分別為56.3～74.1, 7.0～22.4和39.8～46.2。4 ℃保藏的樣品皆呈澄清金黃色，37 ℃保藏組呈金黃色，25 ℃保藏組介于兩者之間。色差值的變化趨勢(shì)與褐色指標(biāo)(表2)一致，其褐色指標(biāo)明顯低于表1的試驗(yàn)組，可能因?yàn)樘砑泳S生素C具有抑制多酚褐變的效果，以及表2試驗(yàn)組的貯藏時(shí)間較短。

表3 復(fù)合酶與維生素C并冷沉淀處理對(duì)滇橄欖還原汁在14天保藏后色差值的影響Table 3 Effects of multiple enzymes, vitamin C, and cold-precipitation treatments on the colorimetric parameters of restored juice from P. emblica fruit after 14-day storage

2.3 滇橄欖還原果汁色澤的PCA和OPLS-DA

a-PCA圖；b-OPLS-DA圖；c-OPLS-DA模型的置信檢驗(yàn)結(jié)果圖；d-OPLS-DA模型的VIP預(yù)測(cè)值分布圖圖3 滇橄欖還原果汁的PCA及OPLS-DA 分析結(jié)果Fig.3 Results for PCA and OPLS-DA of restored juices from P. emblica fruit

2.4 滇橄欖還原果汁的色差值與褐色指標(biāo)的關(guān)系

將表2和表3數(shù)據(jù)作相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，為了比較工藝流程IV中不同操作單元對(duì)還原果汁色澤的影響，特地分組比較4、25和37 ℃保藏組(分別為IV04、IV25和IV37組)和加冷沉淀處理組(IV04CP、IV25CP和IV37CP組)。所有樣品組的褐色指標(biāo)與色差值之間具有良好的線性關(guān)系:L*=-71.65×A420+96.91(R2=0.989)(圖4-a，所有組)；a*=61.37×A420-12.74(R2=0.984)(圖4-b, 所有25和37 ℃組，不包括4 ℃組)；b*=75.89×A420+15.42(R2=0.957)(圖4-c, 不包括IV37CP-即37 ℃保藏+冷沉淀組)。大致上，所有4 ℃保藏組的L*，a*及b*無(wú)明顯差異，無(wú)論是無(wú)或有冷沉淀處理。隨著保藏溫度提高到25或37 ℃，褐色指標(biāo)提高，L*值線性降低，a*和b*值線性提高；且冷沉淀處理組比沒(méi)有冷沉淀處理組具有明顯較高的L*值和較低的a*與b*值。此結(jié)果顯示在短期保藏(14 d)下褐色指標(biāo)可以作為估計(jì)滇橄欖汁色差值變化的指標(biāo)。

a-L*值；b-a*值；c-b*值圖4 滇橄欖還原果汁的色差值與褐色指標(biāo)(A420)的關(guān)系Fig.4 Relationships between colorimetric parameters and browning index (A420) of restored juice from P. emblica fruit

2.5 滇橄欖還原果汁褐變動(dòng)力學(xué)

圖5為以復(fù)合酶處理組C1(添加果膠酶、蛋白酶和維生素C、無(wú)冷沉淀處理)為例，闡明滇橄欖還原汁的短期褐色指標(biāo)隨保藏溫度而異的一級(jí)動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象。圖5-a顯示褐色指標(biāo)(A420)在4 ℃下不隨保藏時(shí)間而異，25 ℃下緩慢地線性增加，而37 ℃下呈極明顯上升的斜率且線性非常良好。將37 ℃的數(shù)據(jù)依方程式(3)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果如圖5-b所示，其斜率(即速率常數(shù)kB值)為0.091，相關(guān)系數(shù)(R2)高達(dá)0.961，表明此一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程式可描述96.1%的數(shù)據(jù)變化，符合度極高。

比較了4種復(fù)合酶組在無(wú)冷沉淀(C1～C4)和有冷沉淀(C5～C8)處理下還原果汁的褐變kB值和半褐變時(shí)間(t1/2), 結(jié)果如表4所示。回歸模型的相關(guān)系數(shù)都非常高(R2=0.901～0.996)。在25 ℃下, C1～C4組的kB值為0.018 6～0.036 0 d-1, 褐變t1/2為19.3～37.3 d；而C5～C8組的kB值為0.008 2～0.015 6 d-1，t1/2為44.4～84.5 d。在37 ℃下, C1～C4組的kB值為0.090 8～0.097 1 d-1，t1/2為7.1～7.6 d；而C5～C8組的kB值為0.063 3～0.069 4 d-1，t1/2為10.0～11.0 d，就kB值而言，37 ℃組是25 ℃組的3～5倍(C1～C4組)或4～8倍(C5～C8組)；無(wú)冷沉淀組(C1～C4) 是冷沉淀處理組(C5～C8)的2.5(25 ℃下)或1.4(37 ℃下)倍。不同復(fù)合酶中，果膠酶/蛋白酶組(C1，C5)在有或無(wú)冷沉淀處理下都具有最低的kB值和最大的t1/2值，即最佳的抑制褐變的效果。果膠酶/蛋白酶/單寧酶組加冷沉淀處理(C8)時(shí)也有相同的效果，但不建議采用，因成本較高且單寧酶處理會(huì)促進(jìn)長(zhǎng)期保藏的褐變程度。

a-褐色指標(biāo)；b-37 ℃下一級(jí)動(dòng)力學(xué)圖5 滇橄欖還原果汁的短期褐變速率和37 ℃ 下的動(dòng)力學(xué)關(guān)系(以C1樣品組為例)Fig.5 Short-term browning rates and kinetic relationship at 37 ℃ of restored juice from P. emblica fruit

2.6 不同處理的滇橄欖還原果汁的主要多酚組成

將不同條件處理的滇橄欖果汁4 ℃保藏30 d后解析不同處理?xiàng)l件對(duì)滇橄欖還原汁(表5樣品D1～D9)主要多酚組成的影響。圖6不同處理方式下滇橄欖還原汁中多酚組成的HPLC譜圖。D1～D9樣品鑒定出的主要成分為粘酸沒(méi)食子酸酯(尖峰1)、沒(méi)食子酸O-葡萄糖苷(尖峰2)、沒(méi)食子酸(尖峰3)、沒(méi)食子酸甲酯(尖峰6)和鞣料云實(shí)素(尖峰7)，其化學(xué)組分種類(lèi)不隨處理方式而異。經(jīng)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得各處理前后滇橄欖還原汁的主要成分如表5所示，沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯以及鞣料云實(shí)素的含量分別為12.97～14.14、10.64～11.36以及35.40～45.89 μg/mL。統(tǒng)計(jì)顯著差異分析(P<0.05)結(jié)果顯示，D1～D9的沒(méi)食子酸含量無(wú)明顯差異，不受處理?xiàng)l件所影響；沒(méi)食子酸甲酯含量為D5，D8，D9>D6，D7>D1～D4，顯示大部分酶(尤其是蛋白酶)處理組高于無(wú)酶處理組；而鞣料云實(shí)素含量是D5>D9>D6，D7，D8>D1～D4，類(lèi)似沒(méi)食子酸甲酯的情況。

表4 滇橄欖還原果汁短期保藏過(guò)程中一級(jí)褐變反應(yīng)速率和半褐變時(shí)間Table 4 First-order reaction rates for browning and half-browning time during short-term storage of restored juice from P. emblica fruit

表5 不同處理?xiàng)l件下滇澉欖還原果汁中沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯和鞣料云實(shí)素含量的變化Table 5 Effects of various treatments on the concentrations of gallic acid, methyl gallate ester, and corilagin in restored juice from P. emblica fruit

圖6 滇橄欖還原果汁的多酚組成的HPLC譜圖Fig.6 HPLC chromatograms for the phenolic profiles of restored juices from P. emblica fruit after different treatments 注：D1～D9樣品同表5；1=MG=粘酸沒(méi)食子酸酯， 2=GG=沒(méi)食子酸O-葡萄糖苷，3=GA=沒(méi)食子酸， 6=MGE=甲基沒(méi)食子酸酯，7=CO=鞣料云實(shí)素

圖7為滇橄欖汁化學(xué)成分及褐變指標(biāo)的雙圖，2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為77.5%，PC1貢獻(xiàn)率為49.9%，PC2貢獻(xiàn)率為28.6%。D4中化學(xué)成分粘酸沒(méi)食子酸酯和化合物4含量較高，D5中沒(méi)食子酸甲酯和糅料云實(shí)素的含量較高。D1和D2的距離較近，D3、D6～D9之間的距離較近，則D1和D2的化學(xué)成分含量相似，D3、D6～D9的化學(xué)成分含量相似。但是，褐變值對(duì)樣品的區(qū)分不明顯。

圖7 滇橄欖還原汁的化學(xué)成分及褐變指標(biāo) (A420)的PCA雙圖Fig.7 Biplot of chemical composition and browning value (A420) for restored juice of P. emblica fruit 注：D1～D8為樣品；數(shù)字和酚化合物為圖6 尖峰1～8面積，%

2.7 討論

本研究主要針對(duì)滇橄欖還原果汁保藏過(guò)程中總體的非酶褐變反應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)估?？傮w而言保藏溫度對(duì)果汁的色差值與褐色指標(biāo)的作用最為明顯，保藏溫度越低滇橄欖汁短期保藏后的L*值越高、a*值與b*值越低、褐色指標(biāo)與kB值均越低。原因在于降低體系溫度可以有效減緩美拉德反應(yīng)、維生素C氧化降解和焦糖化反應(yīng)的發(fā)生[20,22]。25和37 ℃下，冷沉淀處理可減少果汁保藏期沉淀的產(chǎn)生，同時(shí)明顯增高果汁的L*值、降低a*值與b*值，降低褐色指標(biāo)與kB值；原因在于預(yù)冷沉淀可以事先去除部分影響果汁色澤的物質(zhì)。沉淀劑對(duì)果汁的色差值與褐色指標(biāo)無(wú)明顯作用，可促進(jìn)冷藏時(shí)沉淀的生成。果膠酶和蛋白酶可略微降低褐色指標(biāo)，對(duì)沉淀程度無(wú)明顯影響；而單寧酶可使褐色指標(biāo)和沉淀程度增加。

添加沉淀劑進(jìn)行冷沉淀并配合蛋白酶處理后，可使滇橄欖果汁在25 ℃下貯藏24 d后的褐變程度僅為對(duì)照組的61%。本研究以褐色指標(biāo)計(jì)算得滇橄欖汁在37 ℃保藏下的kB值為0.063～0.097 d-1，遠(yuǎn)低于滇橄欖果汁的維生素C在高壓加工下的降解速率(2.26～2.90 d-1，即1.57×10-3～2.01×10-3min-1)[23]。與高溫蒸汽處理相比[10]，本研究條件下的滇橄欖果汁在4和25 ℃下貯藏14 d內(nèi)褐變度A420的增加速率較小，而在37 ℃下貯藏14 d內(nèi)的增加速率則較大。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的處理方法可以很好的抑制滇橄欖果汁在4和25 ℃下短期保藏的褐變反應(yīng)，但在37 ℃下效果有限。有研究表明，沒(méi)食子酸可減少蔓越莓汁貯藏時(shí)的褐變指數(shù)[24]。本文進(jìn)一步研究沒(méi)食子酸對(duì)滇橄欖果汁保藏期間褐變的影響，發(fā)現(xiàn)添加沉淀劑(CaCl2)、冷沉淀處理或酶(果膠酶、蛋白酶)處理對(duì)滇橄欖果汁的主要成分沒(méi)食子酸含量無(wú)明顯影響, 但對(duì)沒(méi)食子酸甲酯和鞣料云實(shí)素含量有顯著(P<0.05)的影響，酶(尤其是蛋白酶)處理組大都顯著高于無(wú)酶處理組。VILJANEN等[25]對(duì)越橘汁的研究有相似的結(jié)論，酶混合物(果膠酶和蛋白酶)處理提高了越橘汁中苯甲酸和槲皮素的含量。

本研究創(chuàng)新結(jié)合PCA和OPLS-DA法，系統(tǒng)地總結(jié)了多重工藝操作與貯藏溫度對(duì)滇橄欖還原汁色澤和主要多酚組成分的聚類(lèi)關(guān)系、影響比重及關(guān)鍵因素。發(fā)現(xiàn)云南產(chǎn)地的滇橄欖還原汁(75%甲醇提取)中沒(méi)食子酸O-葡萄糖苷含量最高，不同于廣西的滇橄欖果實(shí)的純甲醇提取物(粘酸沒(méi)食子酸酯與粘酸內(nèi)酯沒(méi)食子酸酯含量最高)[26]以及印度的滇橄欖果實(shí)的70%乙醇提取物(雙沒(méi)食子酸含量最高)[27]。上述主要多酚組成不同受產(chǎn)地、提取溶劑或色譜分析溶劑所影響，需進(jìn)一步研究滇橄欖果汁質(zhì)量指標(biāo)以及主要多酚組成的功能活性與機(jī)理。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)滇橄欖果汁較好的處理工藝為：冷沉淀，果膠酶/蛋白酶處理，4 ℃保藏。此處理?xiàng)l件下的滇橄欖果汁在短時(shí)保藏期內(nèi)的褐色指標(biāo)較小[14 d后(0.115±0.026)]、色差值較優(yōu)[L*值(86.9±2.4)、a*值(-1.49±0.63)、b*值(22.0±3.4)]、無(wú)沉淀，果汁澄清金黃，成本較低。色差值均與褐色值高度線性相關(guān)。動(dòng)力學(xué)分析：37 ℃保藏時(shí)，滇橄欖汁的褐色值隨保藏時(shí)間的變化對(duì)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的符合性高。37 ℃保藏組的kB值為0.063～0.097 d-1，25 ℃組的為0.008～0.036 d-1；冷沉淀處理可使滇橄欖果褐變kB值明顯減小、半褐變時(shí)間t1/2值明顯增大，保藏期沉淀明顯減少。冷沉淀處理的組中，果膠酶/蛋白酶組的kB值最小、t1/2值最大。上述所采用的工藝條件不會(huì)顯著影響滇橄欖果汁中的沒(méi)食子酸含量，但會(huì)顯著提高沒(méi)食子酸甲酯和鞣料云實(shí)素含量，尤其是蛋白酶處理。本研究提供了解決殺青后滇橄欖還原汁在即飲模式下短期貯藏過(guò)程中的褐變與沉淀問(wèn)題的可行方案，結(jié)果可為相關(guān)果汁產(chǎn)品的研發(fā)提供重要參考。未來(lái)還需進(jìn)一步分析澄清后滇橄欖果汁的功能活性、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與感官評(píng)價(jià)，為鮮飲果汁的研發(fā)提供更完整的功能活性信息。