谷振宇，夏苗苗，蘇媛,3，劉川,4，羅華軍，張大偉,4*

1(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌，443002)2(中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308) 3(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津， 300457)4(中國科學(xué)院大學(xué)，北京， 300192)

核黃素，又名維生素B2，是人和哺乳動(dòng)物生長必不可少的一種營養(yǎng)物質(zhì)，在生物體內(nèi)參與多種氧化還原反應(yīng)，尤其在作為黃素酶類的輔酶參與細(xì)胞中傳遞氫的相關(guān)代謝中起到了重要作用[1]。核黃素轉(zhuǎn)化為活性形式：黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸可以參與促進(jìn)生物體內(nèi)碳水化合物的合成、脂肪酸代謝以及呼吸電子鏈傳遞[2]。由于哺乳動(dòng)物自身不能合成核黃素，因而其在飼料行業(yè)、食品醫(yī)藥行業(yè)中都著有廣泛的應(yīng)用[3-4]。

鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黃素生物合成的直接前體[5]，它既可以以糖和氨基酸為底料進(jìn)行從頭合成，也可以利用嘌呤堿為前體進(jìn)行補(bǔ)救合成。嘌呤從頭合成途徑將戊糖磷酸途徑生成的5-磷酸核糖最終轉(zhuǎn)化成GTP和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。以合成GTP為例，其主要可以分為嘌呤操縱子催化5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)生成肌苷酸(inosincacid,inosinemonphosphate，IMP)，以及IMP催化生成GTP兩個(gè)階段。發(fā)酵過程中添加GTP可以提高核黃素產(chǎn)量[6-7]，證明嘌呤前體的有效供應(yīng)對(duì)核黃素的生產(chǎn)至關(guān)重要。并且利用代謝工程策略增強(qiáng)GTP的合成也已有很多報(bào)道[8-10]。

本文選用的核黃素高產(chǎn)菌株S1在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵52 h，核黃素產(chǎn)量可達(dá)27 g/L。在此基礎(chǔ)上利用基于CRISPR/Cas9的堿基編輯器失活嘌呤操縱子阻遏蛋白基因以及鳥嘌呤核苷酸(guanylate,GMP)還原酶來分別提高GTP合成中2個(gè)階段的通量。另一方面嘗試過表達(dá)GMP到2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)嘧啶-4(3H)酮(DARPP)合成途徑的基因以增強(qiáng)GTP的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒

論文中涉及的菌株見表1，質(zhì)粒見表2。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒Table 2 plasmids used in this study

1.1.2 引物

本實(shí)驗(yàn)所涉及的基因序列均來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用SnapGene設(shè)計(jì)所用引物，由金唯智生物公司合成(表3)。

表3 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10；滅菌前用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

SX培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 5；滅菌前用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基YP(g/L)：玉米漿干粉5，蔗糖10、硫酸鎂5，酵母抽提物5，K2HPO43，KH2PO42，滅菌前用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：一水葡萄糖720，玉米漿干粉15，KH2PO40.3，滅菌前用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2,115 ℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

GET3XG三槽獨(dú)立梯度基因擴(kuò)增儀，杭州柏恒科技有限公司；水平電泳儀，北京市六一儀器廠；94-Z水平搖床，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1600可見分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嘌呤合成途徑基因過表達(dá)及失活菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以SG質(zhì)粒為例，以pHP13-spe-PvegI-mcherry質(zhì)粒為模板，用引物pHP131、PvegI-2擴(kuò)增含壯觀霉素抗性基因以及PvegI啟動(dòng)子的pHP13質(zhì)粒骨架，以B.subtilis168基因組為模板，用引物UP-gmk、DN-gmk擴(kuò)增gmk基因片段，將擴(kuò)增出來的2個(gè)片段用Gibson試劑盒兩片段連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化DH5α后，挑取長出的菌落用CXPHP131、CXPHP132引物進(jìn)行驗(yàn)證，正確的轉(zhuǎn)化子大小為1 293 bp，驗(yàn)證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～17 h提取質(zhì)粒。

1.2.1.2 嘌呤合成途徑基因過表達(dá)

向目的菌株中用電轉(zhuǎn)化[11]的方法轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因的過表達(dá)質(zhì)粒，以終質(zhì)量濃度為150 μg/mL的壯觀霉素進(jìn)行篩選獲得正確的轉(zhuǎn)化子后保藏。

1.2.1.3 堿基編輯器質(zhì)粒的構(gòu)建及嘌呤合成途徑基因失活

堿基編輯器失活guaC和purR的質(zhì)?；趯?shí)驗(yàn)室中構(gòu)建的堿基編輯器質(zhì)粒pHP13-spe-dcas9。質(zhì)粒以pHP13為骨架包含復(fù)制起始位點(diǎn)Puc ori，復(fù)制蛋白Pep pTA1060，壯觀霉素抗性基因spe。其余部分包括乳糖/IPTG誘導(dǎo)的阻遏蛋白基因lacI，PgraC啟動(dòng)子表達(dá)dcas9及脫氨酶(adenosine deaminase，AID)，其中dcas9缺失終止密碼子，PvegI啟動(dòng)子連接僅缺少N20的向?qū)NA。在插入N20序列時(shí)，首先需要找到相應(yīng)基因序列前中段合適的NGG序列，NGG序列上游20 bp為N20序列，由于在NGG上游15～20 bp更容易利用堿基編輯器發(fā)生編輯，所以在NGG上游15～20 bp尋找使C變?yōu)門而產(chǎn)生終止密碼子的突變，設(shè)計(jì)N20以構(gòu)建質(zhì)粒。以PDC質(zhì)粒為例，以pHP13-spe-dcas9質(zhì)粒為模板，用引物UP-dcas9-guaC、DN-dacs9擴(kuò)增片段1，用引物UP-dac9、DN-dcas9-guaC擴(kuò)增片段2，將擴(kuò)增出來的2個(gè)片段用Gibson試劑盒兩片段連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化DH5α后，挑取長出的菌落用CX13 spe2、CXJF2引物進(jìn)行驗(yàn)證，正確的轉(zhuǎn)化子大小為624 bp，驗(yàn)證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～17 h后提取質(zhì)粒。

向目的菌株中用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因的堿基編輯器質(zhì)粒，以終質(zhì)量濃度為150 μg/mL的壯觀霉素進(jìn)行篩選獲得正確的轉(zhuǎn)化子后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)使目的位點(diǎn)發(fā)生編輯并且使質(zhì)粒丟失，影印后對(duì)質(zhì)粒丟失的菌進(jìn)行測序，得到相應(yīng)密碼子突變成終止密碼子的菌株進(jìn)行保藏。

1.2.2 核黃素濃度的測定

取500 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP(eppendorf)管中，用0.1 mol/L NaOH溶液稀釋適宜倍數(shù)，避光堿溶20 min取出，12 000 r/min離心1 min，取上清液用分光光度計(jì)檢測444 nm處的吸光度值，以確定核黃素的濃度[12]。

1.2.3 殘?zhí)菧y定

取500 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數(shù)后，用進(jìn)樣針取樣，用生物傳感分析儀對(duì)樣品的殘?zhí)沁M(jìn)行檢測。

1.2.4 蔗糖測定

取200 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP管中，加入200 μL配制好的2 mol/L H2SO4溶液，于60 ℃水浴鍋中水解30 min，加入4 mol/L NaOH溶液200 μL進(jìn)行中和，12 000 r/min離心1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數(shù)，用生物傳感分析儀對(duì)樣品水解后的葡萄糖進(jìn)行檢測，蔗糖的濃度為測得的葡萄糖濃度的2倍。

1.2.5 搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證

從-80 ℃凍存管中取3 μL菌液于含有1 mL無菌水的EP管中，10倍稀釋后混勻，取3 μL涂布SX平板，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取直徑5～6 mm的1個(gè)單菌落接種2支固體試管SX含相應(yīng)抗性的斜面培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用1 mL YP培養(yǎng)基清洗下一支斜面上的所有菌苔于2 mL EP管中，混勻，取300 μL菌液分別接種于含有80 mL YP培養(yǎng)基的500 mL瓶底有擋板的三角瓶中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)41 h。培養(yǎng)過程中分別在11和23 h加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤合成途徑基因失活及補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，purR基因編碼嘌呤合成途徑的阻遏蛋白PurR，敲除purR基因可使嘌呤合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平大幅提升[13-14]：guaC基因?yàn)猷堰屎铣赏緩紾MP還原酶編碼基因，敲除guaC基因[15]可阻斷GMP到IMP的合成，從而使GMP得到一定的積累，間接提高核黃素的產(chǎn)量。因此對(duì)這2個(gè)基因用CRISPER/Cas9介導(dǎo)的基因組堿基編輯器技術(shù)進(jìn)行失活[16-17]，分別得到菌株SDR和SDC，并對(duì)這2個(gè)菌株進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證。

由圖1-b可知，嘌呤合成途徑的阻遏蛋白purR堿基編輯器失活后核黃素產(chǎn)量從2.81降至2.68 g/L，證明高產(chǎn)菌S1中嘌呤合成途徑由PRPP到IMP部分基因轉(zhuǎn)錄水平滿足核黃素的合成，不是該途徑中的限速步驟；而嘌呤合成途徑的回補(bǔ)途徑基因guaC堿基編輯器失活后，阻斷了GMP到IMP的合成，核黃素產(chǎn)量由2.81 g/L提升至3.04 g/L，產(chǎn)量提升8%。41 h時(shí)S1菌以及SDR菌葡萄糖有少量剩余，SDC菌葡萄糖剩余2.67 g/L(圖1-c)，17 h時(shí)搖瓶內(nèi)蔗糖已耗盡。SDC菌株核黃素轉(zhuǎn)化率由S1菌株1 g糖(0.392 g蔗糖、0.608 g葡萄糖)產(chǎn)0.027 5 g核黃素提高至1 g糖(0.399 g蔗糖、0.601 g葡萄糖)產(chǎn)0.030 3 g核黃素，轉(zhuǎn)化率提升10.2%。

a-最大OD600測定值；b-發(fā)酵結(jié)束核黃素終產(chǎn)量；c-補(bǔ)糖前葡萄糖測定圖1 失活基因搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵Fig.1 Feeding fermentation of inactivated gene in shake flask

2.2 嘌呤合成途徑基因過表達(dá)

以上實(shí)驗(yàn)表明guaC基因失活使產(chǎn)量有所增加，推測GMP的供給并沒有達(dá)到飽和。基于此推論，嘗試將gmk和ndk基因進(jìn)行過表達(dá)(gmk編碼鳥苷酸激酶，催化GMP生成GDP，ndk編碼核苷二磷酸激酶，催化GDP生成GTP)，期望通過增加GMP的消耗拉動(dòng)IMP向GMP的轉(zhuǎn)化過程。因此對(duì)這2個(gè)基因以pHP13為質(zhì)粒骨架，PvegI為啟動(dòng)子構(gòu)建質(zhì)粒PG和PN，電轉(zhuǎn)化進(jìn)S1菌株，分別得到菌株SG和SN，并且用攜帶不含啟動(dòng)子及目的基因的空載質(zhì)粒S1-空菌株作為對(duì)照，進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證。

由圖2-a可知，過表達(dá)gmk及ndk后對(duì)菌株生長無明顯影響。圖2-b為核黃素終產(chǎn)量，與對(duì)照菌株S1-空相比，SG菌株及SN菌株產(chǎn)量無明顯提高，41 h時(shí)葡萄糖無剩余(圖2-c)，17 h時(shí)搖瓶內(nèi)蔗糖已耗盡。這說明單獨(dú)表達(dá)這2個(gè)基因并沒有拉動(dòng)GMP的合成，而GTP進(jìn)入核黃素合成途徑可能是更關(guān)鍵的反應(yīng)。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結(jié)束核黃素終產(chǎn)量;c-補(bǔ)糖前葡萄糖測定圖2 gmk、ndk基因過表達(dá)搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵Fig.2 Feeding fermentation of overexpression of gmk and ndk genes in shake flask

2.3 ribA基因異源引入及過表達(dá)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及BRENDA數(shù)據(jù)庫(https://www.brenda-enzymes.info/index.php)查詢得到枯草自身RibA雙功能酶(EC 3.5.4.25及EC 4.1.99.12)，但該酶無法將2個(gè)酶的功能拆分，為了將GTP環(huán)水解酶II單獨(dú)過表達(dá)，查找到希瓦氏菌來源的ribA(EC 4.1.99.12)。以pHP13為質(zhì)粒骨架，以PvegI及Pr為啟動(dòng)子分別對(duì)希瓦氏菌ribA基因進(jìn)行過表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒PSA和PRA，電轉(zhuǎn)化進(jìn)S1菌株，分別得到菌株SSA和SRA，用含空載質(zhì)粒的S1-空菌株作為對(duì)照，進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證。

圖3-a可知，S1-空菌株最大OD600為32.2，SSA及SRA菌株最大OD600有不同程度的下降，分別為30.2和23.3。表明希瓦氏菌ribA的表達(dá)對(duì)菌的生長產(chǎn)生一定的影響，可能與GTP在GTP環(huán)水解酶II催化下產(chǎn)生的DARPP具有一定的細(xì)胞毒性有關(guān)。而Pr啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于PvegI啟動(dòng)子，對(duì)菌的生長抑制也表現(xiàn)的較為明顯，導(dǎo)致核黃素產(chǎn)量下降。圖3-b為發(fā)酵結(jié)束時(shí)核黃素終產(chǎn)量，SSA菌產(chǎn)量提升至3.33 g/L，并且發(fā)酵結(jié)束搖瓶中仍有4.6 g/L的葡萄糖剩余。而SRA菌產(chǎn)量則明顯下降至2.69 g/L，耗糖進(jìn)一步減少，發(fā)酵結(jié)束搖瓶中葡萄糖剩余18.4 g/L(圖3-c)，17 h時(shí)搖瓶內(nèi)蔗糖已耗盡。SSA菌株核黃素轉(zhuǎn)化率為1 g糖(0.407 g蔗糖、0.593 g葡萄糖)產(chǎn)0.033 8 g核黃素，轉(zhuǎn)化率較S1提升22.9%。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結(jié)束核黃素終產(chǎn)量;c-補(bǔ)糖前葡萄糖測定圖3 異源引入基因搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵Fig.3 Feeding fermentation of heterologous introduction of genes in shake flask

2.4 guaC基因失活及ribA基因過表達(dá)組合驗(yàn)證

由以上實(shí)驗(yàn)可知，失活guaC基因可以提高GMP的供給，PvegI啟動(dòng)子過表達(dá)希瓦氏菌來源的ribA基因可以加快GTP的利用，從而拉動(dòng)嘌呤途徑產(chǎn)物的合成使核黃素產(chǎn)量增加，并且認(rèn)為這2種效果是可以疊加的。于是在失活guaC基因的SDC菌中分別轉(zhuǎn)入PSA質(zhì)粒以及PRA質(zhì)粒，得到菌株SDCA和SDCR，并將pHP13-spe空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SDC菌中得到菌株SDCS，用SDCS菌株作為對(duì)照，進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證。

圖4-a表明，搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)Pr啟動(dòng)子表達(dá)希瓦氏菌來源ribA在SDC菌中仍會(huì)抑制生長。SDCA菌株產(chǎn)量進(jìn)一步提升，達(dá)到3.43 g/L，相較于SDCS菌產(chǎn)量提高9.2%，相較于初始菌株S1產(chǎn)量提升21.7%(圖4-b)；并且SDCA菌耗糖也有所減少，發(fā)酵結(jié)束時(shí)搖瓶中剩余葡萄糖3.87 g/L。SDCS菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)沒有葡萄糖剩余(圖4-c)，SDCA菌株轉(zhuǎn)化率為1 g糖(0.404 g蔗糖、0.596 g葡萄糖)產(chǎn)0.034 6 g核黃素，較S1菌株提升25.8%，具有一定的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結(jié)束核黃素終產(chǎn)量;c-補(bǔ)糖前葡萄糖測定圖4 組合基因搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵Fig.4 Feeding fermentation of combined gene in shake flask

3 結(jié)論與討論

S1是1株經(jīng)過誘變及篩選所得的枯草芽孢桿菌核黃素高產(chǎn)菌株，但核黃素合成必須的鳥嘌呤合成途徑并未發(fā)生突變。為了使S1菌株核黃素合成能力進(jìn)一步提升，主要對(duì)嘌呤合成途徑的相關(guān)基因進(jìn)行失活以及質(zhì)粒過表達(dá)，結(jié)果如下：

(1)嘌呤合成途徑支路基因失活：運(yùn)用CRISPER/dCas9介導(dǎo)的基因組堿基編輯器技術(shù)失活guaC基因(編碼GMP還原酶)，阻斷了GMP到IMP的合成，核黃素產(chǎn)量由2.81提升至3.04 g/L，提升8.2%，轉(zhuǎn)化率提升10.2%。

(2)嘌呤合成途徑下游基因過表達(dá)：通過質(zhì)粒將GMP下游合成基因gmk(鳥苷酸激酶)和ndk(核苷二磷酸激酶)進(jìn)行過表達(dá)，核黃素產(chǎn)量沒有明顯提升，由此確定了這兩步反應(yīng)不是核黃素合成的瓶頸。

(3)希瓦氏菌ribA基因引入及過表達(dá)：枯草芽孢桿菌中ribA基因編碼的蛋白為一種雙功能酶，希瓦氏菌中ribA(EC 3.5.4.25)和ribB(EC 4.1.99.12)2種酶可以拆分單獨(dú)存在，故單獨(dú)引入了希瓦氏菌ribA基因(EC 3.5.4.25)，過表達(dá)GTP環(huán)水解酶II部分，將GTP更多的轉(zhuǎn)化為DARPP，增強(qiáng)嘌呤前體的利用。在搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵中核黃素產(chǎn)量由3.09提升至3.33 g/L，并且耗糖有所減少，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖剩余4.6 g/L，核黃素轉(zhuǎn)化率較S1提升22.9%

(4)將guaC基因失活與希瓦氏菌ribA基因過表達(dá)進(jìn)行組合，核黃素產(chǎn)量進(jìn)一步提升至3.43 g/L，較初始菌株S1產(chǎn)量提升21.7%，并且耗糖有少量減少，核黃素轉(zhuǎn)化率提升25.8%，具有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。