孫雅楠 李斯 李潔

(唐山市工人醫(yī)院 1內(nèi)分泌二科，河北 唐山 063000；2心內(nèi)四科；3婦產(chǎn)科)

2型糖尿病(T2DM)是一種復(fù)雜的代謝性疾病，胰島素抵抗及胰島素分泌相對缺乏為其主要特點，目前研究顯示miR-9-3p在調(diào)節(jié)胰島素抵抗及調(diào)節(jié)機體胰島素分泌水平發(fā)揮重要作用〔1，2〕。國內(nèi)外關(guān)于T2DM患者血漿miR-9-3p表達水平的研究較少，沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt1)廣泛存在于機體組織當中，能夠促進胰島β細胞分泌胰島素、提高組織對胰島素的敏感性，參與機體能量代謝，參與DNA損傷修復(fù)等過程，起到延緩組織細胞衰老的作用〔3～6〕。目前研究顯示miR-195、miR-34a均能通過調(diào)節(jié)Sirt1的表達發(fā)揮生物學作用〔7，8〕，目前關(guān)于miR-9-3p對于HepG2細胞中Sirt1表達水平的研究未見報道。本研究通過檢測T2DM患者血漿中miR-9-3p的表達水平，檢測miR-9-3p對HepG2細胞Sirt1表達的影響，探討血漿miR-9-3p在T2DM診療中的價值及miR-9-3p在T2DM發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年6月唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌科收治住院的T2DM患者47例為T2DM組；T2DM患者納入標準：①符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標準的T2DM患者；②BMI 18.5～30.0 kg/m2；③無影響糖代謝的內(nèi)分泌疾病或其他疾病。T2DM診斷標準：依據(jù)1999年WHO標準即葡萄糖耐量試驗：口服溶于300 ml水內(nèi)的無水葡萄糖粉75 g，空腹靜脈血糖 ≥7.0 mmol/L，負荷后2 h靜脈血糖 ≥11.1 mmol/L。排除標準：①1型糖尿病患者；②C肽缺乏的患者；③血壓≥180/110 mmHg；④肝功能異常：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≥實驗室正常值范圍上限的2.5倍；⑤腎功能不全：血清肌酐≥1.5 mg/dl；⑥T2DM大血管、微血管并發(fā)癥患者及近期出現(xiàn)糖尿病急性并發(fā)癥患者；⑦近期有手術(shù)、外傷、感染及其他應(yīng)激狀態(tài)的患者；⑧有嚴重的系統(tǒng)性疾病，如心血管、消化、呼吸、神經(jīng)、免疫、其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等及惡性腫瘤病史；⑨目前妊娠、哺乳期的患者。另選同期年齡性別與之相匹配的醫(yī)院體檢中心體檢健康人員28例為對照組。T2DM組男27例，女20例，平均年齡(54±10)歲，對照組男14例，女14例，平均年齡(55±7)歲，兩組性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇比較無顯著差異(P>0.05)；兩組空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平存在差異顯著(P<0.001)，見表1。本研究由唐山工人醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本的采集 所有研究對象禁食8 h，清晨空腹肘靜脈采血。

1.2.2血漿總RNA的提取 使用mirVana Paris試劑盒提取血漿總RNA，按照說明書操作，置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3cDNA的合成 應(yīng)用qRT-PCR(Taqman探針法)配制RT-PCR體系，反應(yīng)體系為8 μl，10×緩沖液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、inhibition 0.1 μl、RNA 4.5 μl、RNase-free H2O 0.4 μl、RNA Primer 1.5 μl、RTase 0.5 μl，全過程均于冰浴完成。設(shè)定反應(yīng)條件：16℃孵育60 min、42℃孵育60 min、85℃孵育5 min、4℃Forever。

1.2.4qRT-PCR配制 2× TaqMAN universal PCR Master Mix 10 μl、cDNA 4 μl、無核糖核酸酶(RNase-free)H2O 5 μl、TaqMAN probe 1 μl，總反應(yīng)體系為20 μl；反應(yīng)條件為：95℃ 10 min起始模板預(yù)變性，95℃ 15 s中模板變性、60℃ 60 s退火循環(huán)40次；每個樣本均做副管，重復(fù)3次，記錄實驗CT值，取平均值，后經(jīng)2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計學分析。

1.3細胞實驗分組及方法

1.3.1實驗分組 HepG2細胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)研究所細胞中心提供。實驗分為兩組，miR-9-3p轉(zhuǎn)染組：HepG2細胞系體外轉(zhuǎn)染miR-9-3p mimics，陰性對照組：HepG2細胞系體外培養(yǎng)不轉(zhuǎn)染miR-9-3p mimics培養(yǎng)條件與轉(zhuǎn)染組相同。

1.3.2細胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的HepG2細胞的試管加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成105/ml濃度移至培養(yǎng)瓶中，置于37%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞生長鋪滿瓶壁即可傳代。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染 將配制好的miR-9-3pmimic轉(zhuǎn)染復(fù)合物250 μl，加入到培養(yǎng)好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培養(yǎng)基750 μl/孔，加入到各孔中，前后輕柔搖動細胞板至混合均勻。將細胞培養(yǎng)板置于 37℃ 5.0%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染6 h后吸取1 ml普通DMEM培養(yǎng)基(含有20%胎牛血清、無抗生素)，加入各孔。

1.3.4細胞qRT-PCR ①提取細胞總RNA：使用mirVana Paris Kit試劑盒提取細胞總RNA，按照說明書操作，將離心管置于-80℃冰箱保存。②mRNA qRT-PCR(SYBR Green法)操作全過程需在冰浴上進行，Sirt1引物序列：上游5′ CTACTGGTCTTACTT-TGAGGG3′、下游5′CAAGGGATGGTATTTATGCT3′；β-actin引物序列：上游5′ACAGAGCCTCGCCTTTG-C3′、下游5′CCACCATCACGCCCTGG3′，反應(yīng)體系如下：2×One Step SYBR?RT-PCR緩沖液410 μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2、1.0 μl、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μl、Total RNA 4.0 μl(400 ng)、RNase Free H2O 3 μl，總反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 30 min、95℃ 10 min，PCR 95℃ 10 s、60℃ 60 s循環(huán)40次。

1.3.5Western印跡細胞總蛋白的提取 細胞轉(zhuǎn)染完成后應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后應(yīng)用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解獲得細胞總蛋白，應(yīng)用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳過后取目的蛋白條帶恒流200 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用TBST水洗完后，放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗體與一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床過夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗與二抗稀釋液，將膜放入配好的二抗稀釋液，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結(jié)果。

1.3.6考馬斯亮藍法測蛋白濃度 應(yīng)用分光光度計測定并計算每管蛋白的吸光度值，制作出標準曲線。吸取3 μl待測蛋白液，加入到100 μl考馬斯亮藍顯色液，用分光光度計測定并計算出吸光度值，計算出待測蛋白的濃度。

1.3.7轉(zhuǎn)膜及顯色 電泳分離蛋白分子，轉(zhuǎn)膜，將膜放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。加一抗，4℃搖床過夜。加二抗，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0軟件進行χ2檢驗，t檢驗，非參數(shù)檢驗；應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線分析計算出ROC曲線下面積(AUC)和95%CI。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿中miR-9-3p表達水平 T2DM組血漿miR-9-3p的表達水平〔0.033(0.004，0.209)〕明顯高于對照組〔0.004(0.002，0.006),P=0.000 5〕。

2.2ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價值 以健康人群為對照組評價miR-9-3p對于T2DM的診斷價值，AUC=0.742，介于0.7～0.9之間，說明miR-9-3p對于T2DM診斷有一定準確性(95%CI0.628～0.857，P=0.000 5)。見圖1。

2.3miR-9-3p對HepG2細胞 Sirt1轉(zhuǎn)錄水平的影響 HepG2細胞miR-9-3p轉(zhuǎn)染組Sirt1 mRNA水平(0.877±0.255)與陰性對照組(1.003±0.429)相比，無顯著差異(P=0.30)。

2.4miR-9-3p對HepG2 細胞Sirt1蛋白水平的影響 miR-9-3p轉(zhuǎn)染組Sirt1蛋白水平(0.174±0.013)顯著低于陰性對照組(0.623±0.044，P=0.017)。

3 討 論

miR-9-3p在調(diào)節(jié)胰島β細胞分泌胰島素過程中起重要作用。Plaisance等〔9〕的研究最早證實：當胰島β細胞內(nèi)miR-9-3p表達水平升高時，miR-9-3p通過作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來抑制胰島β細胞的分泌功能。之后Ramachandran等〔10〕通過模擬糖尿病發(fā)病時體內(nèi)的高糖環(huán)境再一次證實，在高糖刺激胰島素分泌的過程中，胰島β細胞中miR-9-3p表達水平呈顯著性升高，并通過體內(nèi)實驗進一步證實Sirt1具有促進胰島素分泌的作用，最后在胰島β細胞中證實miR-9-3p的升高能夠使Sirt1蛋白表達水平顯著降低。郭東更等〔11〕以新發(fā)的T2DM患者和正常糖耐量人員外周血單個核細胞為研究對象，研究結(jié)果表明初發(fā)T2DM患者外周血單個核細胞中miR-9-3p水平顯著上調(diào)，并且其三酰甘油水平也是上調(diào)的。

Sirt1對于提高組織胰島素敏感性、促進胰島素分泌和調(diào)節(jié)脂類代謝的平衡發(fā)揮重要作用，目前研究證實，若降低Sirt1蛋白表達水平或降低其蛋白活性均能夠?qū)е乱葝u素抵抗的發(fā)生，科學家檢測出高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠體內(nèi)Sirt1蛋白質(zhì)水平顯著降低并且小鼠表現(xiàn)為過早衰老〔12，13〕，除此之外，人工培養(yǎng)的胰島素敏感細胞如HepG2細胞及平滑肌細胞中，如抑制Sirt1蛋白的表達水平會促進胰島素抵抗的發(fā)生〔14〕。Adlakha等〔15〕運用免疫印跡法證實，在HepG2細胞中miR-128通過介導(dǎo)Sirt1表達水平進一步調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G1的表達水平，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝。Nakae等〔16〕研究顯示，肥胖小鼠肝臟特異性敲除Sirt1基因的表達，不僅升高小鼠血糖水平，增加胰島素抵抗的產(chǎn)生，同時檢測到游離脂肪酸和膽固醇水平顯著提高，證明Sirt1在提高胰島素敏感性及調(diào)節(jié)血脂方面具有重要作用。也有研究證實，在HepG2細胞和小鼠肝臟中增加Sirt1蛋白表示水平，能夠激活基底腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)-激活蛋白激酶，能夠防止脂肪酸合酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚積及其所引起的血糖水平升高及胰島素抵抗〔17〕。本研究證實miR-9-3p調(diào)節(jié)Sirt1蛋白水平的表達。證實miR-9-3p通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HepG2細胞 Sirt1表達。本研究通過細胞試驗進一步證實miR-9-3p能夠靶向抑制Sirt1蛋白的表達，參與調(diào)控胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝途徑，對T2DM胰島素抵抗及血脂異常的發(fā)生可能起到促進作用。