陳若冰 吳素琴 姜玥 劉宵達(dá) 周酈楠 陳再興 徐曉萱

(1遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，遼寧 沈陽(yáng) 110101；中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 2藥理教研室；3臨床醫(yī)學(xué)院)

在前期山藥潛在功能挖掘中發(fā)現(xiàn)古方用山藥具有明目作用〔1〕，干性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)中醫(yī)辨證屬于目昏暗范疇，是老年常見(jiàn)病，晚期會(huì)引起不可逆的視力喪失，其發(fā)病機(jī)制主要為衰老、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮層脂質(zhì)沉積，色素紊亂，功能障礙。在現(xiàn)代藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)山藥中的重要物質(zhì)薯蕷皂苷元具有強(qiáng)抗氧化、抗衰老的作用〔2〕，能夠抑制高血脂、糖尿病的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔3〕，抑制ARPE-19細(xì)胞的過(guò)度增殖和遷移〔4〕，但未見(jiàn)其對(duì)干性AMD作用的報(bào)道，本研究擬分析薯蕷皂苷元對(duì)ARPE-19細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和ARPE-19細(xì)胞增殖、凋亡濃度的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。藥物和試劑：薯蕷皂苷元購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司(批號(hào)：wkq19013103，純度：HPLC≥98%)；碘酸鈉購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司(批號(hào)：wkq19051704，純度：HPLC≥98%)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、CCK8試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物；SOD、MDA試劑盒購(gòu)于北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。儀器和設(shè)備：流式細(xì)胞儀(Beckman，CytoFlex)、酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司 318C)、二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛，Thermo Heracell vios 160i)、分光光度計(jì)(德國(guó)/analytikjena，SPECORD?210 PLUS)、倒置顯微鏡(卡爾蔡司，Axio Vert.Al)、95℃恒溫水浴箱(北京中西華大科技有限公司，m269382)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司，Allegra X-30R)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) ①配制培養(yǎng)基：配制含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基；②細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，胰酶消化、傳代。細(xì)胞置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3藥物配置 碘酸鈉避光保存，取20 mg碘酸鈉溶于10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成濃度為2 mg/ml的碘酸鈉溶液。薯蕷皂苷元組分別溶于PBS中制成濃度為10、20、40、80 μg/ml的薯蕷皂苷元溶液各10 ml。

1.4細(xì)胞分組 分為6組：正常培養(yǎng)組、碘酸鈉預(yù)處理組和薯蕷皂苷元10、20、40、80 μg/ml劑量組；每組4個(gè)孔。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 正常培養(yǎng)組常規(guī)處理培養(yǎng)，碘酸鈉預(yù)處理組予碘酸鈉2 mg/ml預(yù)處理，薯蕷皂苷元各組在予碘酸鈉2 mg/ml處理的同時(shí)分別給予薯蕷皂苷元10、20、40、80 μg/ml進(jìn)行處理。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6CCK8測(cè)定細(xì)胞增殖 用0.5 g/L胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于96孔板內(nèi)接種細(xì)胞懸液(每孔1 000個(gè)細(xì)胞)，分別對(duì)各組加入實(shí)驗(yàn)藥物，將細(xì)胞置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后分別添加10 μl CCK8試劑到每個(gè)孔內(nèi)，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，重復(fù)3次測(cè)定每孔吸光度(OD)，取平均值。

1.7細(xì)胞SOD、GXH-PX、MDA含量測(cè)定 以上6組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞取上清，胰酶消化約2 min，加培養(yǎng)液中止消化，用微量移液器將液體吸出轉(zhuǎn)入至EP管，1 000 r/min離心10 min棄上清，在沉淀細(xì)胞中加入1 ml PBS輕輕吹打，1 000 r/min離心10 min棄上清，加入0.5 ml PBS，懸浮細(xì)胞，進(jìn)行超聲震蕩破碎，稀釋10倍后，按照SOD、GXH-Px、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定BCA蛋白濃度，測(cè)定各組細(xì)胞OD值，計(jì)算SOD、GXH-Px、MDA含量。

1.8細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按實(shí)驗(yàn)方案誘導(dǎo)凋亡，用預(yù)冷PBS離心洗滌，收集105個(gè)細(xì)胞。用雙蒸水稀釋5倍結(jié)合緩沖液為1倍工作液，5 μl FITC-Annexin V和10 μl碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，取補(bǔ)充1倍結(jié)合緩沖液至500 μl輕柔渦旋混勻后。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行流式分析(A)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS22.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞增殖和凋亡濃度比較 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.082、0.665，均P<0.05)；從增殖濃度看，碘酸鈉預(yù)處理組(11.34%±2.82%)低于正常培養(yǎng)組(25.65%±6.05%)及薯蕷皂苷元80(28.63%±3.02%)、40(27.37%±4.53%)和20 μg/ml劑量組(25.49%±4.88%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常培養(yǎng)組高于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組(18.42%±6.22%)，低于薯蕷皂苷元80 μg/ml、40 μg/ml劑量組，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組高于10 μg/ml劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從凋亡濃度看，碘酸鈉預(yù)處理組(30.41%±5.51%)高于正常培養(yǎng)組(8.26%±2.75%)、薯蕷皂苷元各劑量組(10、20、40、80 μg/ml組分別為15.27%±2.70%、15.05%±1.00%、11.42%±0.73%、8.49%±1.53%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常培養(yǎng)組低于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；薯蕷皂苷元各劑量組凋亡濃度與劑量呈反比，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡濃度

2.2各組SOD、GXH-Px、MDA含量比較 6組細(xì)胞SOD、GXH-Px、MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組SOD含量明顯低于正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組(P<0.05)；正常培養(yǎng)組明顯高于薯蕷皂苷元10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組明顯高于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元40 μg/ml劑量組明顯高于10 μg/ml劑量組(P<0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組GXH-Px含量明顯高于正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組(P<0.05)；正常培養(yǎng)組明顯高于薯蕷皂苷元10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組明顯高于20、10 μg/ml劑量組(P<0.05)；其他各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組MDA含量明顯高于正常培養(yǎng)組、薯蕷皂苷元各劑量(P<0.05)；MDA含量隨薯蕷皂苷元濃度升高而降低，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

色素上皮細(xì)胞是血-視網(wǎng)膜屏障的組成部分，參與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，具有營(yíng)養(yǎng)光感受器，吞噬感光細(xì)胞碎片等作用，當(dāng)氧化損傷、炎癥等因素導(dǎo)致色素上皮細(xì)胞損傷時(shí)，視網(wǎng)膜色素上皮層脂質(zhì)沉積及色素紊亂，逐漸出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能障礙，玻璃膜疣增多，脈絡(luò)膜新生血管形成。晚期疾病不可逆，導(dǎo)致失明，因此，色素上皮細(xì)胞損傷被學(xué)者們公認(rèn)為干性AMD病理改變的始動(dòng)環(huán)節(jié)〔5,6〕。在疾病早期積極干預(yù)，阻止視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的損傷是干預(yù)干性AMD病情進(jìn)展的重要措施。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮損傷的重要因素，氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，增多的氮自由基及高活性分子氧自由基在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中堆積，促進(jìn)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞凋亡和抑制增殖。

碘酸鈉是一種無(wú)機(jī)氧化劑，使用碘酸鈉進(jìn)行造模是干性AMD研究者常用的方法，碘酸鈉注射小鼠使視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能改變，引起視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷和死亡〔7,8〕。本研究中碘酸鈉引發(fā)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，模擬AMD發(fā)生有效。薯蕷皂苷元是一種自然合成的甾體皂苷元，藥屬螺甾烷醇糖苷元，廣泛存在于豆科和薯蕷科植物中〔9〕，是山藥的重要活性成分，薯蕷皂苷元抗氧化作用的研究主要集中在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及抗腫瘤治療等方面〔10,11〕。本研究表明薯蕷皂苷元具有抑制碘酸鈉損傷視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的功能，能促進(jìn)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞增殖，阻止凋亡，說(shuō)明薯蕷皂苷元具有抗氧化凋亡和促進(jìn)增殖的作用，且與劑量正相關(guān)。

細(xì)胞的增殖和凋亡與細(xì)胞氧自由基關(guān)系密切，氧自由基活性極強(qiáng)，能引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸結(jié)構(gòu)和功能，促使細(xì)胞凋亡，抑制正常增殖。氧自由基的含量與細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)有關(guān)〔12〕，抗氧化酶活性降低，可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)氧自由基堆積〔13〕，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，生成大量MDA〔14〕。SOD是細(xì)胞最重要的氧自由基清除劑，可清除細(xì)胞中過(guò)多的氧自由基。GSH-Px是一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的重要過(guò)氧化物分解酶。能保護(hù)細(xì)胞膜不受過(guò)氧化物損害。本研究結(jié)果表明薯蕷皂苷元具有增強(qiáng)SOD、GSH-Px活力的作用，且與劑量相關(guān)，薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組效果最明顯。MDA含量是考察細(xì)胞受到氧化威脅的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果說(shuō)明碘酸鈉預(yù)處理組脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞損傷程度超過(guò)正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元各劑量組，與碘酸鈉能誘發(fā)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷相一致，也驗(yàn)證薯蕷皂苷元具有抗氧化作用。

綜上，薯蕷皂苷元能抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，能通過(guò)增加SOD、GSH-Px活力，清除氧自由基，降低MDA含量，保護(hù)ARPE-19細(xì)胞，促進(jìn)增殖，阻止凋亡。且其抗氧化作用與薯蕷皂苷元?jiǎng)┝烤哂邢嚓P(guān)性，以80 μg/ml劑量組效果最明顯。作為山藥的重要活性成分，薯蕷皂苷元在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用，也為山藥的明目功能提供了現(xiàn)代藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)室支持。