何章彪 王翠俠 韓文杰 趙琳 陳奎生

(1商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校五官科，河南 商丘 476100；2商丘市第一人民醫(yī)院腫瘤科；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(MTSS)1是由Lee等〔1〕通過改良的mRNA差異顯示技術(shù)在研究膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因,該基因定位于人類染色體8q24.1區(qū)域,是一個(gè)轉(zhuǎn)移抑制候選基因，編碼5.3 kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白(Gli)1是局域性蛋白質(zhì)配體(Hh)信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，其表達(dá)水平增高標(biāo)志著Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于激活狀態(tài)，在正常情況中對(duì)Hh信號(hào)通路起正調(diào)控作用〔2〕。有關(guān)食管鱗癌組織中MTSS1和 Gli1蛋白表達(dá)及其意義尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用免疫組化和原位雜交法觀察食管鱗癌組織中MTSS1和Gli1蛋白表達(dá)，探討其與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及MTSS1和Gli1的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 標(biāo)本選取商丘市第一人民醫(yī)院2018年6月至2019年12月經(jīng)病理證實(shí)的手術(shù)切除新鮮食管鱗狀上皮細(xì)胞癌標(biāo)本，共計(jì)136例，男88例，女48例，年齡48～81歲，平均(64±5.1)歲，患者的臨床及病理資料完整，術(shù)前均未進(jìn)行化放療和免疫治療?；颊吆炗喼橥鈺筮M(jìn)行病理取材，所取標(biāo)本分別為遠(yuǎn)端正常黏膜組織、癌旁3 cm內(nèi)組織、無壞死癌灶處組織，癌灶區(qū)標(biāo)本病理證實(shí)為食管鱗狀上皮細(xì)胞癌。136例癌旁組織中經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)有96例為中-重度不典型增生組織。按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：轉(zhuǎn)移組74例和無轉(zhuǎn)移組62例。所有標(biāo)本取材后放入10%多聚甲醛固定(在固定液中加入0.1%二乙基焦碳酸酯以抑制RNA酶的活性)，病理標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片。對(duì)食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜分別進(jìn)行HE染色、免疫組化和原位雜交染色。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 MTSS1抗體為鼠單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(ab56780)，工作濃度1∶130 稀釋；Gli1抗體為兔單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司 (ab49314)，工作濃度1∶200稀釋，多聚體分子(Envision)免疫組化試劑盒(二K5007DAB顯色系統(tǒng))購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司；胃蛋白酶、預(yù)雜交液及核固紅均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；堿性磷酸酯酶標(biāo)記(SP-AP)及堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(BCIP/NBT)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，MTSS1探針(5′-GGTCCACTGAGCCCCACACATTGTT-3′)，Gli1探針(5′-AGGAGCGGCGGCTGACAGTATAGGC-3′) 由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織經(jīng)40 g/L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化及原位雜交檢測(cè)。

1.3.2免疫組織化學(xué) 免疫組化SP法染色步驟按照試劑盒及一抗(濃度為1∶100)說明書要求進(jìn)行，同時(shí)用購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(MTSS1和Gli1)的陽(yáng)性對(duì)照片進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照及用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3原位雜交 參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預(yù)雜交液進(jìn)行雜交及雜交前用核糖核酸酶(RNase)處理樣本作陰性對(duì)照〔3,4〕。

1.3.4免疫組化和原位雜交結(jié)果判定 在高倍鏡視野下對(duì)目標(biāo)區(qū)域連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色深淺評(píng)分：樣本無染色為0分；樣本弱染色為1分；樣本中等染色為2分；樣本強(qiáng)染色為3分。將樣本兩者得分相乘記為總分。根據(jù)分?jǐn)?shù)把樣本界定為4類：0～1為陰性(-)，2～4為陽(yáng)性(+)，5～8為中陽(yáng)性()，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性()〔3,4〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化與原位雜交結(jié)果 MTSS1主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)中，染色呈淡黃至棕黃色。MTSS1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)主要存在于細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)中，呈棕紫色顆粒。Gli1主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，染色呈淡黃至棕黃色。Gli1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕紫色顆粒。見圖1。

2.2食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1的蛋白及mRNA表達(dá) 見表1。MTSS1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈低表達(dá)，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈高表達(dá)；Gli1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈低表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1 食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA的表達(dá)(SP,×400)

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及其正常組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)比較〔n(%)〕

2.3MTSS1及Gli1蛋白表達(dá)與食管癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表2、表3。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中MTSS1蛋白〔12例(16.2%)〕及mRNA表達(dá)〔6例(8.1%)〕均明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相應(yīng)組織〔28例(45.2%)、45例(72.6%)〕，Gli1蛋白〔68例(91.9%)vs 47例(75.8%)〕及mRNA表達(dá)〔64例(86.5%)vs 21例(34.0%)〕均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相應(yīng)組織(均P<0.05)。

2.4MTSS1和Gli1的相關(guān)性分析 食管鱗癌組織中MTSS1蛋白與Gli1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.422，P<0.001)。見表2。食管鱗癌組織中MTSS1 mRNA與Gli1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.389，P<0.001)。見表3。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中MTSS1與Gli1蛋白的表達(dá)情況(n)

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中MTSS1與Gli1 mRNA的表達(dá)情況(n)

3 討 論

3.1Hedgehog信號(hào)通路與食管鱗癌的關(guān)系 Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在進(jìn)化上高度保守并有重要生物學(xué)功能。胞膜上的受體 Patched(Ptch1、Ptch2)、胞外配體Hh及跨膜蛋白(Smo)和細(xì)胞內(nèi)部的下游轉(zhuǎn)錄因子鋅指核轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成了Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔2〕。Hedgehog通路調(diào)控胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分化和增殖。Hedgehog信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道包括：前列腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌、胃癌、白血病、小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤，在這些報(bào)道中提到了發(fā)現(xiàn)該通路存在異常的激活。在Hh通路上任何成員的突變或缺失都可能導(dǎo)致信號(hào)傳遞的改變〔3〕。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道該信號(hào)通路的異常激活與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系〔4〕。信號(hào)傳導(dǎo)分子Gli在Hh信號(hào)通路中起到重要作用，Hh通路末端的轉(zhuǎn)錄激活因子Gli1蛋白在Hh相關(guān)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著必不可少的作用〔5〕。因此Gli 的表達(dá)水平可以作為反映 Hh信號(hào)通路活性的一個(gè)可靠指標(biāo)，Gli1表達(dá)異常可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲性生長(zhǎng)。

本研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜中Gli1的蛋白的表達(dá)依次降低，這表明Hh信號(hào)通路與食管鱗癌的發(fā)生關(guān)系密切，Hh信號(hào)通路在食管鱗癌中活化這一觀點(diǎn)得到了支持。通過Gli1蛋白的表達(dá)結(jié)果和臨床病例資料對(duì)比分析顯示，與腫瘤的浸潤(rùn)程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這提示Hh信號(hào)通路有可能參與了食管鱗癌的侵襲性生長(zhǎng)，可通對(duì)Hh信號(hào)通路調(diào)控來抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

3.2MTSS1與食管鱗癌的關(guān)系 目前對(duì)于MTSS1的作用和功能還存在一定的爭(zhēng)議。早期研究〔6〕發(fā)現(xiàn)MTSS1在未轉(zhuǎn)移的膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，在高轉(zhuǎn)移的膀胱癌細(xì)胞株中低表達(dá)，這提示在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中MTSS1有可能是一個(gè)有抑制能力的蛋白。MISS1可能作用于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。但是有學(xué)者認(rèn)為MISS1的低表達(dá)和腫瘤的侵襲性轉(zhuǎn)移相關(guān)性有待進(jìn)一步研究，MTSS1并非都是作為一個(gè)轉(zhuǎn)移抑制因子存在，如Yao等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中MTSS1 mRNA及蛋白上調(diào)，且MTSSl是肝癌早期病變的誘導(dǎo)者,寇煒等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)MISS1在膀胱癌中表達(dá)下降，但與膀胱癌的侵襲行為無關(guān)。張曙光等〔9〕采用免疫組化和RT-PCR等方法研究發(fā)現(xiàn)MTSS1在食管鱗癌組織和細(xì)胞低表達(dá)，這與本研究結(jié)果相一致。本研究提示MTSS1在食管鱗癌的侵襲性生長(zhǎng)過程中可能作為一個(gè)抑制信號(hào)，但是其具體發(fā)揮的作用尚有待進(jìn)一步研究。

3.3MTSS1在Hedgehog信號(hào)通路中的作用 MTSS1自從發(fā)現(xiàn)以來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其作為一種細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)受到信號(hào)肽(Shh)的調(diào)控〔10〕。Shh作為Hh信號(hào)通路中的一種重要的信號(hào)肽，在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)，控制著不同類型祖細(xì)胞的比表達(dá)。Shh可以通過下游Gli信號(hào)分子控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增值和分化，同時(shí)也參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散〔11〕。作為Shh通路上的相關(guān)基因MTSS1能夠協(xié)同Gli轉(zhuǎn)錄從而激活Shh途徑的轉(zhuǎn)錄〔12〕。在眾多Gli的啟動(dòng)基因中，在多種組織系統(tǒng)中MTSS1可以促使其轉(zhuǎn)錄。MTSS1、Gli1/Gli2及Gli相關(guān)蛋白細(xì)胞內(nèi)調(diào)控組分(Sufu)三者合成三元絡(luò)合物，Gli介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄受到促進(jìn)，進(jìn)一步促進(jìn)了成瘤和瘤體生長(zhǎng)過程及腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲〔13〕。所以MTSS1可能是Shh的一個(gè)靶基因，通過Shh途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有關(guān)Hedgehog信號(hào)通路的研究，以該通路對(duì)腫瘤發(fā)生及瘤體生長(zhǎng)的作用居多，但最近有關(guān)肝癌、卵巢癌、胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，過度活化的通路也會(huì)促進(jìn)腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔14〕。但MTSS1在該通路中如何促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。

本研究將食管鱗癌組織中MTSS1的表達(dá)和Hedgehog信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子Gli1的表達(dá)對(duì)比分析顯示，其蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。但在食管鱗癌的發(fā)生遷移過程中，MTSS1是否參與Hedgehog信號(hào)的表達(dá)調(diào)控及Hedgehog信號(hào)通路是否參與了食管鱗癌的侵襲性生長(zhǎng)和遷移尚不甚明了。在食管鱗癌中，MTSS1的表達(dá)調(diào)控有可能和Hedgehog信號(hào)通路中的某些分子存在相互抑制作用，也有可能MTSS1只是在一定階段或一定濃度下對(duì) Hedgehog信號(hào)通路其調(diào)控作用，這些問題都有待于進(jìn)一步討論研究。