孫鵬 孟巖 張劍 齊艷秀 劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病是嚴重影響人們健康的一種慢性代謝性疾病，日益受到國內(nèi)外科研工作者的廣泛關注。在糖尿病所有類型中，2 型糖尿病最為多見，占所有病例的90%以上〔1〕。糖尿病眼病是由糖尿病引起的一類眼部并發(fā)癥的總稱，其中最典型的是糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)，它是導致患者視力下降、受損甚至失明的主要原因〔2〕。糖尿病眼病的發(fā)病機制錯綜復雜，諸多血管刺激和抑制因子在其演進過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)因其具有顯著的促血管生成作用，故其在糖尿病眼病病理過程中的作用備受人們關注〔3〕。有關研究報道，在糖尿病眼病的演進過程中，可檢測到VEGF表達和水平的增加，但對于糖尿病眼病的各時間段VEGF水平的具體情況沒有進行深入探討〔4〕。在糖尿病的模型制備中，目前人們主要以大鼠為研究對象，通過注射鏈脲佐菌素(STZ)來促使其發(fā)展為糖尿病模型〔5〕。本研究利用STZ誘導大鼠構(gòu)建糖尿病模型，并利用神經(jīng)生長因子(NGF)和抗VEGF進行干預后，觀察大鼠血清血糖和VEGF的變化，檢測大鼠視覺電生理視網(wǎng)膜暗反應(ERG)，并研究大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應激水平和VEGF含量，以明確抗VEGF藥物對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的防治作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級(SPF)8周齡健康雄性Wistar大鼠(體重210～250 g)80只(長春億斯實驗動物技術有限責任公司)，分籠(5只/籠)飼養(yǎng)。動物采用自由飲水攝食飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：空氣相對濕度50%～70%，環(huán)境溫度19～22℃，明暗交替光照周期為12 h/12 h。

1.2實驗儀器與試劑 鏈佐霉素(美國Sigma公司)；水合氯醛(廣州市醫(yī)藥公司)；VEGF一抗(武漢博士德公司)；二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋公司)；MP150生理記錄儀(美國BioLab公司)；組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；石蠟切片機、展片機(德國Leica公司)；恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)。

1.3實驗分組和模型建立 將大鼠隨機平均分為正常對照組、模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組各10只。正常對照組給予正常飲食，其他3組給予高脂高糖飲食。持續(xù)4 w后，進行造模，造模前先禁食24 h，然后模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組腹腔注射STZ(50 mg/kg)，正常對照組則腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。造模72 h后，采集尾靜脈血檢測空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG≥16.7 mmol/L為模型制備成功。

1.4給藥 誘導糖尿病模型后繼續(xù)飼養(yǎng)至16 w，待模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變后，進行如下給藥處理：NGF組在肌肉和眼球玻璃體腔內(nèi)分別注射NGF和生理鹽水，NGF+抗VEGF組兩部位分別注射NGF和抗VEGF藥物，而正常對照組兩部位則注射生理鹽水，連續(xù)給予3 w。

1.5大鼠房水中VEGF和FBG含量檢測 各組實驗大鼠尾靜脈取血測FBG，眼球房內(nèi)取房水采用VEGF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(AE98006Ra，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)測VEGF水平。

1.6ERG檢查 大鼠暗適應1 h以上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.3 g/kg體重。麻醉狀態(tài)的大鼠固定于大鼠實驗臺上，右眼滴加復方托吡卡胺滴眼液(美多麗)散瞳，滴加鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)表面麻醉。將記錄電極、參考電極和接地電極分別與右眼角膜表面、兩眼間和尾部進行連接。用MP150生理記錄儀進行ERG記錄，反應光強為0.38 cd·s/m2。檢測結(jié)束后，點氯霉素眼藥水以預防感染。

1.7視網(wǎng)膜組織中丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測 將實驗大鼠視網(wǎng)膜組織進行充分研磨，并制備成10%組織勻漿液。常溫進行離心(2 000 r/min)后，收集上清液，用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和可見光分光光度計測定各組視網(wǎng)膜組織中MDA、CAT和SOD含量變化。

1.8免疫組化檢測VEGF蛋白表達 將切片進行烤片30 min；常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復、封閉后，用抗VEGF抗體(稀釋比為1∶50)在4℃孵育過夜；用二步法免疫組化檢測試劑盒操作后，進行DAB顯色；浸入蘇木素染液5 s進行復染，然后浸入1%HCl/酒精30 s進行分化；蒸餾水徹底沖洗后，置于自來水中放置2 h；常規(guī)脫水、透明、封片后利用圖像采集系統(tǒng)采集并分析結(jié)果。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組房水中VEGF水平和FBG比較 各組注射3 w后，與正常對照組相比，其余3組VEGF水平、FBG明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組VEGF水平有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而FBG差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組房水中VEGF和FBG比較

2.2各組ERG檢查 各組注射3 w后，與正常組比較，模型組、NGF組ERG檢查b波潛伏期顯著延遲(P<0.05)，振幅明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組ERG檢查b波潛伏期顯著縮短(P<0.05)，振幅明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組ERG潛伏期和幅值變化

2.3各組視網(wǎng)膜組織中MDA、CAT和SOD含量檢測 各組注射3 w后，與正常對照組相比，模型組MDA含量明顯升高、CAT和SOD含量明顯降低(P<0.05)；模型組比較，NG組和NGF+抗VEGF組MDA、CAT、SOD含量差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組視網(wǎng)膜中MDA、CAT和SOD含量測定

2.4各組VEGF蛋白表達 由免疫組化結(jié)果所見，VEGF主要表達于內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層。與正常對照組相比，VEGF在模型組、NGF組和 NGF+抗VEGF組的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，VEGF在NGF組和NGF+抗VEGF組的蛋白表達水平明顯減少(P<0.05)；與NGF組相比，VEGF在NGF+抗VEGF組的表達水平明顯減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組眼球視網(wǎng)膜中VEGF蛋白檢測(免疫組化，×400)

3 討 論

隨著DR發(fā)病率程逐年上升的趨勢，DR的防治已成為糖尿病并發(fā)癥研究領域中迫在眉睫的重要課題。建立可復制性、合理性和可靠性的動物模型是深入研究DR發(fā)病機制、評判藥物治療效果及制定防治、防御措施的重要環(huán)節(jié)之一。DR實驗動物模型建立是否可行、可靠和穩(wěn)定及其與人類DR的類似度，直接關系到實驗研究結(jié)果。經(jīng)典的糖尿病動物模型主要包括以下4類，分別為化學物質(zhì)(如STZ和四氧啼唆)誘導動物模型、自發(fā)性遺傳性動物模型、胰腺部分切除動物模型和轉(zhuǎn)基因動物模型〔6〕。STZ誘導糖尿病大鼠模型一直備受科研人員的推崇，其具有對大鼠周圍組織毒性小，模型死亡率低、穩(wěn)定性高，模型建立簡便易行、操作程序簡化等特點。STZ是一種專門選擇性破壞動物胰島β細胞的藥物，其作用是通過誘導產(chǎn)生一氧化氮(NO)實現(xiàn)的。在體內(nèi)，NO具有參與自由基級聯(lián)反應、抑制線粒體功能、β細胞代謝和胰島素分泌等作用，結(jié)果可使FBG升高〔7〕。然而，STZ對視網(wǎng)膜則沒有毒性作用。目前認為，利用STZ注射建立糖尿病動物模型的使用劑量沒有統(tǒng)一標準〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，小劑量多次注射STZ可成功建立糖尿病動物模型，該方法與糖尿病發(fā)生發(fā)展的自然病程相近，能使胰島功能發(fā)生漸進性損傷，且可有效降低模型動物的死亡率。此外，有研究認為，雌性鼠建立糖尿病動物模型的成功率較雄性鼠更低，其原因與雌激素對血管具有保護作用有關〔10〕?；诖耍菊n題選用雄性大鼠作為研究對象。

針對視網(wǎng)膜電生理的研究，劉文舟等〔11〕的研究結(jié)果顯示，DR患者ERG的a、b波振幅(尤其是b波的振幅)改變敏感。在DR早期，當眼底未發(fā)生病理改變時，就可檢測到ERG異常。ERG可敏感并客觀反映出視網(wǎng)膜內(nèi)層血液循環(huán)的狀態(tài)。尤其是在DR患者住院的前期已經(jīng)出現(xiàn)Ops總波振幅降低并伴有子波振幅選擇性降低的現(xiàn)象〔12〕。所以，Ops波在DR患者早期診斷和治療效果評價有著不可替代的重要價值〔13〕。目前認為，DR早期病變中即可出現(xiàn)Ops總波幅變化，提示其是DR早期診斷敏感的指標之一〔14〕。此外，Ops還可反映視網(wǎng)膜損害的情況，沈泓等〔15〕研究表明，Ops 總波振幅與DR病情成反比，與許建華等〔16〕發(fā)表的結(jié)論一致。DR的出現(xiàn)再一次證明糖尿病患者的病程已經(jīng)發(fā)展到不可逆的階段，眼部周圍的微環(huán)境已經(jīng)受到了破壞。隨著患者病程期的延續(xù)和患者血液里FBG值持續(xù)的升高，DR出現(xiàn)的概率會更大〔17〕。

本實驗結(jié)果表明，VEGF蛋白表達對糖尿病眼病的發(fā)生和發(fā)展過程起到了重要作用，因糖尿病眼病患者的玻璃體VEGF濃度高，可能與玻璃體為矯治物體相關，可利于VEGF 的濃縮及儲存〔18〕。在視網(wǎng)膜中分泌VEGF后，滲入玻璃體中儲存。而房水中VEGF是在睫狀突形成后，經(jīng)后房循環(huán)，從小梁網(wǎng)進入房水靜脈內(nèi)，經(jīng)房水中循環(huán)，從而形成 VEGF 水平上升〔19〕。已經(jīng)有學者研究顯示〔20〕，玻璃體VEGF水平上升，是導致糖尿病患者出現(xiàn)玻璃體DR的獨立危險因素。VEGF為最新檢查出的新生血管生長因子，其具有較強的促分裂能力〔21〕。眼睛未出現(xiàn)病變時，視網(wǎng)膜周邊細胞、內(nèi)皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞均會形成較低的 VEGF，已經(jīng)有學者研究表示〔22〕，VEGF在糖尿病眼病發(fā)展中具有重要作用。相較于未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變患者，視網(wǎng)膜病變組的 VEGF 水平明顯較高，且與血清胰島素樣生長因子(IGF)-1、胰島素抵抗呈密切相關性，在不同眼部疾病房水中，VEGF濃度同樣存在差異。研究結(jié)果顯示〔23〕，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者，慢性閉角型青光眼患者及新生血管性青光眼患者VEGF水平均有明顯差異(P<0.05)。在正常情況下，組織中VEGF表達水平較低，而當組織血供豐富且代謝旺盛時，VEGF 水平將相應升高，同樣，在病理條件下，其表達也會升高。

綜上，在2型糖尿病患者DR中，VEGF 水平明顯上升，IGF-1 水平隨之上升，呈相互影響關系〔24〕。隨著我國科研工作者和世界上科研人員對糖尿病眼病的發(fā)病機制不斷深入的研究，對糖尿病眼病患者的治療技術和方法也會可獲得突飛猛進的發(fā)展。