解娜 王建發(fā) 楊秀麗 殷國田 趙國安

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 1第三附屬醫(yī)院心內科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2第一附屬醫(yī)院心內科)

心力衰竭(HF)是由心臟結構或功能性疾病引起的心室充盈和/或射血功能受損所致〔1〕。血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)可導致心肌細胞肥大。AT1激活了幾種細胞內信號轉導途徑，在沒有高血壓的情況下，AT1局部過表達也可能促成心肌肥大的發(fā)病機制〔2〕。心肌錨定重復蛋白(CARP)為人內皮細胞中的細胞因子(白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α)誘導型轉錄輔因子〔3，4〕。研究表明，CARP既是核轉錄的輔助因子，又是肌小節(jié)Ⅰ帶中與肌動蛋白相關的伸展感覺復合體的組成部分，參與肌原纖維的組裝和伸展感覺。動物模型發(fā)現肥厚型心肌細胞中CARP的表達顯著上調。在因擴張型心肌病，局部缺血性心臟病和心律失常性右室心肌病導致代償性HF的患者中也觀察到相同現象〔5〕。在生理條件下，自噬可以清除心肌細胞中的衰老細胞器和受損的蛋白質，以維持心臟功能和心臟形狀，在心臟病中，自噬水平的改變也可能導致受損的線粒體積聚，從而影響心臟功能〔6〕。黃杞總黃酮具有很強的抗氧化和消除自由基作用，黃杞總黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質的磷酸化、鈣離子的轉移、自由基的清除、抗氧化活力的增強、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達〔7〕。黃杞總黃酮具有抗炎癥、抗過敏、抑制細菌、抑制寄生蟲、抑制病毒、防治肝病、防治心血管疾病、防治血管栓塞、防治心與腦血管疾病、抗腫瘤、抗化學毒物的療效〔8〕。本研究擬探討黃杞總黃酮對慢性HF大鼠AT1/CARP信號通路及心肌自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD大鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(渝)2019-0011，動物使用許可證號：SYXK(渝)2019-0013，動物質量合格證號：NC00190346；雌雄不限，10～12周齡，體重220～300 g。大鼠在12∶12 h的明暗周期中飼養(yǎng)，并飼喂標準飲食和純凈水。本動物實驗經新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準執(zhí)行。

1.2主要藥物、試劑及儀器 黃杞總黃酮(原料藥，純度≥98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號SW30117)；纈沙坦片(北京諾華制藥有限公司，規(guī)格40 mg/片，批號20190811)；細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G0170-100T、FS-14993)；TRIzol試劑(北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司，批號LGTZ001)；第一鏈cDNA合成試劑盒(艾美捷科技有限公司，批號NGB-54400)；SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(凱杰生物工程深圳有限公司，批號208059)；蛋白質提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號SF2672-25、P0006)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(德國默克密理博公司，批號SVLP04703)；AT1單克隆抗體、CARP單克隆抗體、β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體(英國Abcam公司，批號sc-22006、sc-53566、sc-0016)；羊抗鼠二抗(上海中科英沐生物科技有限公司，批號PB001F7)；增強型化學發(fā)光試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號YK-10P2)；GE 730型彩色多普勒超聲診斷儀(美國通用電氣公司)；BX53TR型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；E100型光學顯微鏡(日本尼康公司)；7300型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司)；Tanon 5200型化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3動物建模及給藥 將72只大鼠通過戊巴比妥鈉腹膜麻醉，于胸骨左緣第3、4肋間開胸，暴露心臟，使用6.0無創(chuàng)縫合線用于結扎左前降支(LAD)冠狀動脈(距左心耳和肺動脈椎體之間的主動脈根3～4 mm)?？p合胸壁后發(fā)現共8只大鼠死亡，且術后1 w，行心臟彩超檢測，當左心室射血分數(LVEF)<45%視為慢性心力衰竭大鼠模型制備成功〔6〕。共成功造模64只大鼠，將造模成功的大鼠按隨機數表法分成4組：模型組、纈沙坦組〔9〕(50 mg/kg)、黃杞總黃酮低、高劑量組(250、500 mg/kg)〔7〕，每組16只。另取16只無任何處理措施的大鼠為對照組。纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組于建模成功后第1天，給予相應藥物灌胃，灌胃體積10 ml/kg，對照組及模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥4 w。

1.4超聲心動指標的測定 使用彩色多普勒超聲診斷儀進行超聲檢查，使用二維超聲心動圖顯示左心室的長軸，測量與心臟功能相關的參數，如左心室舒張末期內徑(LVIDd)、左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室短軸縮短率(FS)、射血分數(EF)。

1.5心肌自噬指數的測定 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其頸椎脫臼處死，剝離心臟，獲取心肌組織。常規(guī)制作心肌組織切片，MDC法測定細胞自噬水平。操作如下：將切片用PBS洗滌5 min兩次后，向每個切片中加入0.05 mmol/L MDC，在37℃的保護下避光孵育1 h，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，將載玻片固定在用PBS洗滌并固定后在4%多聚甲醛中放置15 min。通過熒光顯微鏡觀察細胞，細胞質內出現酸性自噬小體(綠色)，說明細胞發(fā)生自噬。每個標本捕獲5張圖像，記錄心肌細胞和自噬細胞的總數并計算平均值。自噬指數的計算公式如下：自噬指數=自噬細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.6大鼠心肌病理結構觀察 將心肌組織制備石蠟切片(5 m/片)，采用HE試劑盒染色后置于光學顯微鏡下觀察。

1.7qRT-PCR測定心肌組織AT1、CARP mRNA水平 TRIzol試劑從大鼠心肌組織提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Kit試劑盒進行定量PCR擴增。引物由碧云天生物技術研究所合成。AT1引物正向5′-GTTCTGGAATTGCGTGCTTT-3′，反向5′-TGCTTCATGAGCCAAGTCAC-3′；CARP引物正向5′-TTGATGTCCAGCTGAGTYCCT-3′，反向5′-CTTGAAGGGATCGCTCATGT-3′。β-actin用作內部對照，β-actin引物正向5′-TGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3′、反向5′-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。循環(huán)程序如下：95℃ 2 min，然后在95℃變性持續(xù)5 s 30個循環(huán)，在56℃退火30 s，在68℃延伸30 s。PCR總反應體積為20 μl，包含10 μl SYBR Green PCR Kit，0.8 μl正向引物，0.8 μl反向引物，2 μl cDNA模板和6.4 μl ddH2O。采用2-ΔΔCt法計算AT1、CARP mRNA的相對表達水平。

1.8Western印跡測定心肌組織AT1、CARP蛋白水平 將心肌組織樣品裂解30 min，并使用蛋白質提取試劑盒提取總蛋白，通過Bradford試劑盒測定蛋白質濃度，隨后將等量的蛋白質(20 μg)加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的每個泳道上，電泳在80 V(堆積凝膠)/ 120 V(分離凝膠)的恒定電壓下進行，將蛋白質樣品電印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，然后加入AT1、 CARP、β-actin一抗(均為1∶1 000)在4℃下孵育過夜。加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)與膜在室溫下孵育1 h，通過增強型化學發(fā)光試劑進行觀察。使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)獲取結果，計算AT1、 CARP蛋白和β-actin蛋白(作為內部對照)的密度比，作為相對表達量。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠心功能指標比較 與對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低高劑量組LVIDd、LVIDs明顯降低，FS、EF明顯升高；且黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs明顯低于黃杞總黃酮低劑量組，FS、EF明顯高于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs、FS、EF與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠心肌細胞自噬情況比較 與對照組〔(8.96±3.54)%〕比較，模型組大鼠自噬指數水平明顯升高〔(56.96±4.29)%,P<0.05〕。與模型組比較，纈沙坦組〔(21.63±4.99)%〕、黃杞總黃酮低劑量組〔(41.63±5.96)%〕、黃杞總黃酮高劑量組〔(20.47±5.87)%〕自噬指數水平明顯降低，且黃杞總黃酮高劑量組自噬指數水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組自噬指數水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組自噬指數水平與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞自噬顯微觀察(甲基綠染色，×400)

2.3各組大鼠心肌組織病理結構比較 對照組心肌結構正常；模型組心肌橫紋紊亂，心肌細胞明顯腫脹，出現空泡情況(箭頭所示)，肌纖維溶解明顯，有明顯炎癥細胞浸潤；纈沙坦組及黃杞總黃酮高劑量組心肌炎癥細胞浸潤減少，心肌纖維排列整齊；黃杞總黃酮低劑量組心肌仍有明顯病理變化。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理(HE染色，×400)

2.4各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯降低；且黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖3。

表2 各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較

1～5：對照組，模型組，纈沙坦組，黃杞總黃酮低劑量組，黃杞總黃酮高劑量組圖3 各組大鼠心肌組織AT1、CARP蛋白表達

3 討 論

黃杞總黃酮是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其他包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。由于黃杞總黃酮分子量小，可被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，具有保護血管、防動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細胞的功能〔10，11〕。黃杞總黃酮可有效清除體內的氧自由基，黃杞總黃酮可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的10倍以上，這種抗氧化作用可以阻止心肌細胞的自噬〔12〕。此外，黃杞總黃酮可改善血液循環(huán)，降低膽固醇，這些作用大大降低了心腦血管疾病的發(fā)病率，也可改善心腦血管疾病的癥狀〔13〕。本研究說明，黃杞總黃酮對慢性HF大鼠心功能機心臟病理改變有明顯保護作用，這與上述討論一致。

心臟在病理情況下，隨著內部環(huán)境和應力條件的變化(例如缺乏能量、氧化損失和線粒體膜通透性過渡孔的開放)，心肌細胞自噬將相應增強。研究表明，自噬對于維持心臟功能至關重要，心肌細胞自噬水平的升高可引起細胞器功能障礙，例如線粒體鈣離子的積累〔14〕。本研究說明，黃杞總黃酮能明顯降低心肌細胞自噬水平，進而保護慢性HF大鼠心功能。

AT1通過作用于心肌細胞的特定受體誘導心臟重構，AT1是G蛋白耦聯(lián)受體家族成員，血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的心肌肥大主要由AT1介導。Ang Ⅱ的正性變力和變力作用會增加耗氧量〔15〕。AT1激活特定的酪氨酸激酶途徑并引起酪氨酸磷酸化，然后激活細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白酪氨酸激酶(JAK)。JNK可以通過培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞中的Ang Ⅱ通過AT1激活〔16〕。ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族的關鍵成員，與Ang Ⅱ誘導的心肌肥大密切相關。JAK/轉錄激活因子(STAT)途徑是與Ang Ⅱ誘導的心肌肥大密切相關的另一種途徑，它不同于促細胞分裂劑激活的蛋白激酶家族〔17〕。細胞實驗發(fā)現缺氧的H9C2細胞及缺血/再灌注(I/R)期間的大鼠心肌中AT1表達持續(xù)升高。在阿霉素誘導的心肌病心肌中也觀察到AT1表達升高，與心肌細胞自噬和細胞丟失有關。最近的研究表明，AT1可能加重Ang Ⅱ或壓力超負荷引起的心肌細胞自噬〔18〕。越來越多的證據表明細胞自噬發(fā)生在各種心血管疾病中，包括肥厚性心肌病，缺血性心臟病和充血性心力衰竭。心肌細胞自噬促進心臟疾病的發(fā)展和進程，是重要的治療靶點〔19〕。研究發(fā)現CARP在大鼠胚胎心臟H9C2細胞中表達，與DNA損傷基因153(GADD153)基因密切相關，并受到缺氧的雙重調控，GADD153過表達加重H9C2細胞自噬，而CARP表達隨之下調；還顯示出CARP通過抑制ERK1/2和轉化生長因子(TGF)-β信號傳導途徑來減輕心肌肥大，而與心肌細胞自噬無關〔20〕。CARP還作為核轉錄輔因子，已被證明對心臟基因表達和心臟形態(tài)發(fā)生負調控。動物實驗證明了CARP在受缺氧/復氧(H/R)損傷的培養(yǎng)的心肌細胞中均下調，它們都是公認的自噬模型〔21〕。本研究結果提示，黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進而抑制AT1 CARP信號通路的激活，從而抑制心肌自噬。

綜上，黃杞總黃酮對慢性HF大鼠心肌功能及心臟病理改變有明顯保護作用，能明顯降低心肌細胞自噬水平；其機制可能與黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進而抑制AT1/CARP信號通路的激活有關。