莊和必 俞子承 林二培 黃華宏

(浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

木材(次生木質(zhì)部)的形成是一個涉及形成層細胞分裂、細胞伸長、次生壁大量沉積、細胞程序性死亡、心材形成等步驟的重要生物學過程，受到復雜的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡調(diào)控(Plomionetal., 2001)。已報道，BLH(BEL1-like homeodomain)和KNOX (KNOTTED-like homeodomain)與次生壁形成密切相關，它們均屬TALE(Three amino-acid loop extension)基因家族。BLH亞基因家族起源古老，幾乎存在于所有物種中(Bellaouietal., 2001)，如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有13個成員，水稻(Oryzasativa)中有14個成員(Arnaudetal., 2014, Hamantetal., 2010 , Mukherjeeetal., 2009)。BLH家族基因成員均具有一個高度保守的HD結(jié)構(gòu)域以及HD上游的SKY和BEL結(jié)構(gòu)域，這3個結(jié)構(gòu)域?qū)LH蛋白功能的行使具有十分重要的意義(Beckeretal., 2002)。在擬南芥中，BLH6、BLH7和BLH10被發(fā)現(xiàn)可能冗余地調(diào)控植物次生壁形成(Liu, 2015)，且BLH6能通過形成OFP4-BLH6-KNAT7復合物的形式參與擬南芥花序莖中管狀分子的發(fā)育，進而調(diào)控擬南芥次生壁的形成(Liuetal., 2015)。表達分析還顯示BLH7和BLH10在擬南芥的花序莖中高表達，BLH7可以與肉桂酰輔酶A還原酶(CCR1)啟動子結(jié)合，可能與木質(zhì)素的合成有關(Taylor-Teeplesetal., 2015)。此外，Ma等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，在棉花(Gossypiumhirsutum)中也存在著與擬南芥類似的次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡，棉花BLH家族成員(BLH1、BLH5和BLH6)可以與GhKNAT7和其他轉(zhuǎn)錄因子(OFP1、OFP4和MYB75)相互作用形成復合物，直接與木質(zhì)素和纖維素生物合成基因的啟動子結(jié)合，調(diào)控纖維次生細胞壁的形成。這些研究表明，BLH轉(zhuǎn)錄因子在植物次生壁發(fā)育等重要的生物學過程中具有重要調(diào)控作用。

光皮樺(Betulaluminifera)屬樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)落葉喬木，是我國特有的優(yōu)良速生用材樹種(鄭萬鈞，1983)。廣泛分布于云南、貴州、四川、廣西和浙江等省區(qū)。光皮樺具有生長快、童期短、材質(zhì)優(yōu)良等特點，其木材質(zhì)地良好，供制各種器具； 樹皮、葉、芽可提取芳香油和樹脂，具有較高的經(jīng)濟價值。材性改良一直是光皮樺育種的主要目標之一。近年來，有關光皮樺木材形成相關的分子機制也取得了一些進展。如Cai等(2018)利用RNA-seq技術對光皮樺應拉木形成過程的基因表達譜進行了分析，鑒定獲得了一批在應拉木形成過程中差異表達的基因，并篩選得到了18個與纖維素合成酶基因共表達的轉(zhuǎn)錄因子。Huang等(2014)通過原位雜交和表達模式分析發(fā)現(xiàn)在光皮樺的8個纖維素合成酶基因中有3個與次生細胞壁合成有關。俞子承等(2019)在光皮樺中克隆了一個木質(zhì)素合成關鍵酶-咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)基因，表達分析發(fā)現(xiàn)其在木質(zhì)化莖段中優(yōu)勢表達，且隨著木質(zhì)化程度提高而逐漸增強，單核苷酸變異情況分析表明該基因在不同基因型中存在豐富SNP變異且在演化進程中主要受到了純化選擇壓力。但是目前還沒有BLH基因參與調(diào)控光皮樺木材形成的研究報道。

因此，基于光皮樺基因組序列，對光皮樺BLH基因進行了鑒定，克隆獲得了BlBLH1基因，明確了其序列特征和進化關系，并分析了BlBLH1在光皮樺不同組織、器官和應拉木處理過程中的表達模式。同時，利用酵母雙雜交技術，篩選獲得了與BlBLH1互作的蛋白，且進一步利用BiFC驗證了BlBLH1與3個KNOX蛋白的互作關系。這些結(jié)果將為深入研究BlBLH1基因在光皮樺木材形成中的功能和調(diào)控機制提供重要基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用2年生光皮樺無性系‘G49-3’作為基因克隆和表達分析的材料，所用植株均種植于浙江農(nóng)林大學林木種質(zhì)資源圃的溫室大棚內(nèi)，樣品采集時間為2019年3月至7月。收集的材料包括根(R)、未木質(zhì)化莖(S1)、木質(zhì)化莖(S2)、嫩葉(YL)、成熟葉(ML)、雌花序(FI)和雄花序(MI)等7種不同組織器官。其中，根(R)取自無性系‘G49-3’的水培苗； 未木質(zhì)化莖(S1)和木質(zhì)化莖(S2)分別取當年生主枝上距枝頂端0～2 cm間和10～12 cm間的莖段； 嫩葉(YL)和成熟葉(ML)分別取自當年生主枝自上而下第2片和第5片； 雌、雄花序在3月中旬采集。應力木(Reaction wood)是指在外力作用下形成的彎曲樹干或樹枝 (劉一星等, 2012)。由于其具備的特殊材質(zhì)，應拉木已成為研究闊葉樹木材形成機制的重要模型之一。為了分析基因在應拉木形成過程中的表達，選取主干筆直、生長狀況良好且較為一致的2年生無性系‘G49-3’植株，將其傾斜擺放，使其主干與垂直方向成45°，在處理30天、60天和90天時，剪取應力區(qū)莖段，將皮剝?nèi)ズ蟛杉瘧?tension wood, TW)及對照組(CK)的外層木質(zhì)部，液氮速凍后保存于-80 ℃，用于檢測基因在應拉木中的表達。植株取樣的生物學重復至少3次。

1.2 基因鑒定與生物信息學分析

根據(jù)Hamant等 (2010)的報道，從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載13個擬南芥BLH蛋白序列。利用本地Blast軟件將擬南芥BLH蛋白序列與光皮樺基因組序列(未發(fā)表)進行比對獲得候選序列； 然后利用在線工具FGENESH(Softberry, http://www.softberry.com/berry.phtml)預測候選序列的基因結(jié)構(gòu)并獲得cds和蛋白序列，最后利用在線工具InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)進一步分析候選基因的保守結(jié)構(gòu)域完整性，確定編碼BLH基因的序列。選擇其中1個基因進行克隆驗證，并利用DNASTAR軟件包確定預測其ORF、編碼氨基酸序列、相對分子量和等電點。利用DNAMAN軟件進行多序列比對，MEGA7.0的鄰接(neighbor joining，NJ)算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 RNA提取與基因克隆

使用PureLinkTMPlant RNA Reagent試劑盒(Thermo Fisher)提取不同組織器官及應拉木的RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用Nanodrop測定RNA的純度和濃度，合格的RNA樣本凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)鑒定獲得的基因序列，在5′和3′非翻譯區(qū)設計引物BlBLH1-FF/FR，用于基因克隆，引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript II cDNA第1鏈合成試劑盒(TaKaRa)進行，采用Ex Taq?酶(TaKaRa)進行PCR擴增，將擴增得到的目的片段連接到pEASY-T1 Cloning Kit(TransGen)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，挑取陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 熒光定量PCR

采用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選擇SYBR?Premix Ex-TaqTM試劑盒(TaKaRa)進行定量PCR，定量PCR在CFX96TM Real-Time PCR儀(Bio-Rad)上進行，程序如下： 95 ℃預變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(此步完成時采集熒光信號)，共40個循環(huán)。光皮樺BlEF1α作為內(nèi)參基因(劉文哲等, 2016)，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。熒光定量PCR引物序列見表1。不同器官組織和應拉木的表達數(shù)據(jù)用Duncan法進行多重比較。

1.5 BlBLH1互作蛋白篩選

提取光皮樺‘G49-3’莖和葉的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用CloneMiner II cDNA Library Construction Kit試劑盒(Thermo Fisher)構(gòu)建光皮樺莖葉cDNA文庫，通過LR反應將cDNA片段重組至表達載體上(pGADT7)后轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細胞，獲得酵母雜交文庫，計算滴度為5.23×107CFU·mL-1，總克隆數(shù)為2.09×108個，文庫質(zhì)量較高，可用于后續(xù)文庫篩選實驗。利用引物BlBLH1-F/R將BlBLH1基因構(gòu)建至載體pGBKT7，將構(gòu)建好的pGBKT7-BlBLH1載體轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold，經(jīng)毒性和自激活檢測后用于文庫雜交，雜交方法參照Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System(Clontech)試劑盒說明書進行。文庫雜交后，提取陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑單克隆進行測序，將測序獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，確定互作的蛋白注釋信息。針對篩選獲得的BlKNOX4、BlKNOX9和BlSTM基因，分別利用引物BlKNOX4-F/R、BlKNOX9-F/R和BlSTM-F/R將其構(gòu)建至pGADT7載體，并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，與pGBKT7-BlBLH1進行雜交，在酵母SD/-Leu/-Trp二缺培養(yǎng)基(以下簡稱DDO)、酵母SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/+X-α-Gal/+AbA四缺培養(yǎng)基(以下簡稱QDO/X/A)上篩選，驗證它們的互作關系。酵母雜交所用引物均列于表1。

1.6 雙分子熒光互補(BiFC)實驗

利用引物BlBLH1-inF/R、BlKNOX4-inF/R、BlKNOX9-inF/R、BlSTM-inF/R分別PCR擴增出BlBLH1、BlKNOX4、BlKNOX9和BlSTM的ORF序列，采用ClonExpress?II One Step Cloning Kit試劑盒(Vazyme)將BlBLH1插入到pSAT1-cEYFP的多克隆位點中，將其余基因分別插入到pSAT1-nEYFP的的多克隆位點中，提取質(zhì)粒，通過PEG介導轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體 (賴葉林等, 2020)，利用激光共聚焦顯微鏡(卡爾蔡司LSM880)觀察并拍照記錄蛋白互作信號。

表1 本研究中使用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 BlBLH1基因的克隆

通過生物信息學的方法，在光皮樺基因組中鑒定獲得BLH家族基因。選擇其中1個進行克隆，經(jīng)PCR和測序驗證后將其命名為BlBLH1(GenBank登錄號為MW835211)。序列分析表明該基因序列長度為2 128 bp，包括210 bp 5′UTR、88 bp 3′UTR和1 830 bp ORF，編碼609個氨基酸，相對分子量為66.8 kDa，等電點為7.89。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，光皮樺BlBLH1與其他植物的BLH蛋白序列類似，都具有一個高度保守的HD結(jié)構(gòu)域，以及HD結(jié)構(gòu)域上游的SKY和BEL結(jié)構(gòu)域(圖1)。進一步的系統(tǒng)進化分析也表明，BlBLH1與擬南芥BLH1聚為一個分枝，有較近的親緣關系(圖2)。

2.2 BlBLH1基因的表達分析

通過定量PCR，對BlBLH1基因在不同組織、器官及應拉木形成過程中的表達進行了分析。結(jié)果表明，BlBLH1在不同組織器官中的表達存在顯著差異，其在雄花序中的表達量最高，其次是雌花序，但在根和非木質(zhì)化莖段中幾乎不表達； 在莖段中，BlBLH1在木質(zhì)化莖段(S2)中的表達則明顯高于非木質(zhì)莖段(S1)(圖3A)。分析BlBLH1在應拉木形成過程中的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在應拉木形成過程中的表達呈明顯上升的趨勢，在處理30天、60天和90天時的表達量分別為對照的1.44、3.30和2.56倍(圖3)。綜上，BlBLH1可能不僅參與了光皮樺花序等器官發(fā)育，也可能莖段木質(zhì)化過程中起重要作用。

2.3 BlBLH1互作蛋白的篩選

利用酵母雙雜交技術在光皮樺莖葉文庫中篩選出了47個與BlBLH1較強互作的蛋白(圖4A，表2)?；蜃⑨尩慕Y(jié)果表明，這47個蛋白可大致分為3類： 第一類為結(jié)構(gòu)蛋白，如葉綠素a/b結(jié)合蛋白、細胞色素b6-f亞基等； 第二類為酶，如L-抗壞血酸過氧化物酶(APX)、甲酸脫氫酶(FDH)等； 第三類為轉(zhuǎn)錄因子，如GATA、KNOX等轉(zhuǎn)錄因子，其中與BlBLH1互作的KNOX轉(zhuǎn)錄因子包括BlKNOX4、BlKNOX9和BlSTM(與擬南芥STM同源的光皮樺KNOX轉(zhuǎn)錄因子)3個成員(表2)。

圖1 BlBLH1與同源BLH多序列比對分析Fig. 1 Amino acid residue alignment analysis of the BlBLH1 and Homologous BLHsBl: 光皮樺 Betula luminifera； Ptr: 毛果楊 Populus trichocarpa； Gs: 野大豆 Glycine soja.

圖2 BlBLH1與擬南芥BLH的系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of BlBLH1 and BLH proteins fromA. thaliana ATH1: ARABIDOPSIS HOMEOBOX 1.

BLH與篩選獲得的3個KNOX蛋白互作驗證結(jié)果表明，含有pGADT7-BlKNOX4、pGADT7-BlKNOX9和pGADT7-BlSTM的酵母菌株分別與含pGBKT7-BlBLH1的酵母菌株雜交后，在篩選培養(yǎng)基(QDO/X/A)上均呈現(xiàn)陽性(顯藍色)，與文庫雜交的結(jié)果一致，但BlSTM與BlBLH1的互作較弱(圖4B)。

2.4 體內(nèi)驗證蛋白互作

利用BiFC技術進一步驗證BlBLH1和3個KNOX蛋白在植物細胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果如圖5所示，BlBLH1-cEYFP、BlKNOX4-nEYFP、BlKNOX9-nEYFP和BlSTM-nEYFP單獨轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后，并未顯示黃色熒光信號； 而將BlBLH1-cEYFP與BlKNOX4-nEYFP、BlKNOX9-nEYFP和BlSTM-nEYFP分別共轉(zhuǎn)擬南芥原生質(zhì)體后，可以觀察到BlBLH1和BlKNOX4、BlBLH1和BlKNOX9蛋白可以發(fā)生相互作用呈現(xiàn)黃色的熒光信號，但是BlBLH1-cEYFP 和BlSTM-nEYFP的組合未產(chǎn)生黃色熒光。這些結(jié)果說明BlBLH1與BlKNOX4，BlBLH1與BlKNOX9間存在互作，而BlBLH1與BlSTM蛋白在植物細胞內(nèi)沒有互作關系。

2.5 BlKNOX4、BlKNOX9基因的表達模式

為了進一步分析BlBLH1與BlKNOX4、BlKNOX9之間的關系，采用熒光定量PCR對BlKNOX4、BlKNOX9在不同組織器官和應拉木處理過程中的表達進行了檢測。結(jié)果顯示，BlKNOX4和BlKNOX9在不同組織器官中的表達趨勢基本一致，

圖3 BlBLH1在不同組織、器官和應拉木形成過程中的表達分析Fig. 3 Expression analysis of BlBLH1 in different tissues, organs and tension wood formation標有不同小寫字母的樣品表示在0.05水平差異顯著。R: 根; YL: 嫩葉; ML: 成熟葉； FF: 雌花序; MF: 雄花序; S1: 未木質(zhì)化莖段; S2: 木質(zhì)化莖段; TW: 應拉木; CK: 對照。Different small letters above columns indicate significant difference at 0. 05 levels. R: Root; YL: Young leaf; ML: Mature leaf; FF: Female inflorescence; MF: Male inflorescence; S1: Non-lignified stem; S2: Lignified stem; TW: Tension wood.

表2 BlBLH1文庫雜交陽性克隆比對結(jié)果①Tab.2 The BLAST results of BlBLH1 yeast library hybridization positive clones

續(xù)表2 Continued

圖4 酵母雙雜交部分陽性克隆鑒定及驗證Fig. 4 Detection and verification of the positive clones from yeast two hybridA：部分陽性克隆鑒定； B：BlBLH1與3個KNOX蛋白的互作結(jié)果驗證。A： Detection of partial positive clones; B： Verification of the interactions between BlBLH1 and 3 KNOX proteins. LamT： 陰性對照； 53T： 陽性對照； 圖4A中不同數(shù)字代表不同的陽性克??； 圖4B數(shù)字代表稀釋倍數(shù)，如1∶10表示稀釋10倍。LamT: Negative control; 53T: Positive control; Different numbers in Fig. 4A represent different positive clones; Numbers in Fig. 4B represent dilution ratio, such as 1∶10 for dilution ratio.

圖5 BiFC驗證BlBLH1與3個BlKNOX 蛋白的相互作用(Bar=10 μm)Fig. 5 Verification of interactions among BlBLH1 and three KNOX proteins by using BiFC (Bar=10 μm)第一列為擬南芥葉片原生質(zhì)體細胞的YFP熒光信號，第二列為葉綠體自發(fā)熒光，第三列為明場下的擬南芥原生質(zhì)體，第四列為YFP熒光、葉綠體自發(fā)熒光和明場的疊加。The first column is yelow fluorescent signal of YFP in Arabidopsis protoplast cells, the second column is chloroplast spontaneous fluorescence, the third column is the bright-field image of Arabidopsis protoplast, and the fourth column is the merged image of YFP fluorescence, chloroplast spontaneous fluorescence and bright-field.

在木質(zhì)化莖中表達量最高，其次是非木質(zhì)化莖，在雌花中居于第3位，在其他器官中表達量較低； 在應拉木處理過程中，BlKNOX4先上調(diào)表達，然后在90天恢復至對照水平；BlKNOX9的表達也呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢(圖6)。BlKNOX4和BlKNOX9在莖段和應拉木中表達規(guī)律與BlBLH1基本一致，這表明BlKNOX4、BlKNOX9在莖段和應拉木中可能與BlBLH1存在共表達的關系，推測共同參與了光皮樺木材形成的過程。

3 討論

不同植物BLH基因家族成員在次生細胞壁的生物合成及纖維發(fā)育調(diào)控的時空表達有所差異。已報導，擬南芥BLH1優(yōu)勢表達在種子和莖中 (Kimetal., 2013)。而棉花GhBLH部分成員的表達則在棉纖維發(fā)育第20和25天時達到相對較高水平 (Maetal., 2019)。浙江紅山茶(Camelliachekiangoleosa)CcBLH6的表達水平和果實木質(zhì)化過程呈正相關 (Yanetal., 2021)。使用cDNA微陣列技術檢測到加拿大松(Pinuscanariensis)PcBLH1(Contig04961) 在次生生長的頂芽中優(yōu)勢表達(Chanoetal., 2021)。本研究測定了光皮樺應拉木形成過程中BlBLH1的表達變化，發(fā)現(xiàn)有明顯上調(diào)趨勢，并且木質(zhì)化(S2)莖段高于非木質(zhì)化莖段(S1)，推測BlBLH1參與了光皮樺莖的木質(zhì)化過程。

圖6 BlKNOX4和BlKNOX9在不同組織、器官和應拉木處理過程中的表達分析Fig. 6 Expression analysis of BlKNOX4and BlKNOX9 in different tissues, organs and treatment process of tension wood標有不同小寫字母的樣品表示在0.05水平差異顯著。R:根; YL: 嫩葉; ML: 成熟葉； FF: 雌花序; MF: 雄花序; S1: 未木質(zhì)化莖段; S2: 木質(zhì)化莖段; TW: 應拉木; CK: 對照。Different small letters above columns indicate significant difference at 0. 05 levels. R: Root; YL: Young leaf; ML: Mature leaf; FF: Female inflorescence; MF: Male inflorescence; S1: Non-lignified stem; S2: Lignified stem; TW: Tension wood. CK：Control.

BLH和KNOX、OFP蛋白之間的互作是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要途徑 (Bhattetal., 2004 , Coleetal., 2006 , Hackbuschetal., 2005)。例如，BLH3與OFP1互作調(diào)控擬南芥營養(yǎng)期到生殖器的轉(zhuǎn)化 (Zhangetal., 2016) 。在擬南芥莖尖分生組織中，PNF/PNY能夠和KNOX家族的STM以及BP相互作用，形成BLH-KNOX二聚體 (Smithetal., 2003)。BLH1和KNAT3互作形成二聚體，通過直接靶向ABI3來調(diào)節(jié)ABA介導的發(fā)育過程 (Kimetal., 2013)。此外，在擬南芥、棉花等多種植物中的研究表明，部分BLH和KNOX蛋白的互作是調(diào)控植物次生壁發(fā)育重要機制。例如，BLH6與KNAT7互作，能抑制REV(REVOLUTA) 基因的表達進而抑制擬南芥次生壁的形成 (Liuetal., 2014)。Ma等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，棉花BLH家族成員(GhBLH1、GhBLH5和GhBLH6)可與GhKNAT7、GhOFP1、GhOFP4、GhMYB75等轉(zhuǎn)錄因子形成復合物，與木質(zhì)素(GhCAD5、GhCOMT1等)和纖維素生物合成基因(GhCESA4/7/8)的啟動子結(jié)合，形成次生細胞壁的調(diào)控網(wǎng)絡。筆者也發(fā)現(xiàn)，BlBLH1與2個BlKNOX蛋白存在互作關系，且在莖段木質(zhì)化和應拉木形成過程中協(xié)同表達來調(diào)控木質(zhì)素、纖維素等的形成，這為深入研究BlBLH1在木材細胞壁成分合成及結(jié)構(gòu)功能提供了重要線索。通過酵母文庫雜交還篩選到了F-box、WD40、PAL、XTH等與BlBLH1互作的蛋白，但這些蛋白與BLH的互作關系及其調(diào)控功能卻均未見報道。

4 結(jié)論

本研究在光皮樺中分離獲得BlBLH1基因，其編碼609個氨基酸，具有典型的HD、BELL和SKY結(jié)構(gòu)域，在進化上雖與BLH1聚為一類，但在表達上有差異。BlBLH1在雌花、雄花中優(yōu)勢表達，并與BlKNOX4、BlKNOX9存在蛋白互作，在木質(zhì)化莖及應拉木形成過程中有相似表達趨勢。