魏 威 何玉英 李朝霞 周雨欣 李 健 謝擁軍

中國(guó)對(duì)蝦基因的克隆及其在pH、碳酸鹽堿度脅迫下的表達(dá)分析*

魏 威1,2何玉英2李朝霞1①周雨欣3李 健2謝擁軍4

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 山東 青島 266237；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；3. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 4. 河北省水產(chǎn)良種與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)保護(hù)總站 河北 石家莊 050011)

采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)獲得中國(guó)對(duì)蝦()基因cDNA全長(zhǎng)，命名為。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析了的組織表達(dá)及其在pH和碳酸鹽堿度脅迫下的表達(dá)特征，并利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證其功能?；蚍治鲲@示，cDNA全長(zhǎng)為2225 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?10 bp，編碼269個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)分子量為31.103 kDa，理論等電點(diǎn)為5.59，為疏水性蛋白，包含1個(gè)APG5自噬相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不包含信號(hào)肽。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，具有高度保守性，與凡納濱對(duì)蝦()同源性最高(98.14%)。組織表達(dá)分析顯示，在中國(guó)對(duì)蝦各組織中均有表達(dá)，肌肉中表達(dá)量最高(<0.05)，血淋巴細(xì)胞中最低(<0.05)。pH脅迫后48 h在鰓中的表達(dá)量最低，為對(duì)照組的1.68倍；脅迫后96 h最高，為對(duì)照組的2.67倍。碳酸鹽堿度脅迫后12 h，在鰓中表達(dá)量最高，為對(duì)照組的2.77倍；脅迫后96 h最低，為對(duì)照組的1.30倍。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH和碳酸鹽堿度脅迫下，沉默基因會(huì)使中國(guó)對(duì)蝦死亡率顯著增高(<0.05)，表明該基因的表達(dá)量越高，越有利于中國(guó)對(duì)蝦存活。實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明，在pH、碳酸鹽脅迫下的表達(dá)量均顯著升高(<0.05)，推測(cè)自噬可能參與中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)對(duì)非生物脅迫的調(diào)控。本研究結(jié)果對(duì)水生動(dòng)物特別是甲殼動(dòng)物中細(xì)胞自噬研究具有重要的借鑒意義，有助于推進(jìn)中國(guó)對(duì)蝦鹽堿水養(yǎng)殖的研究進(jìn)程。

中國(guó)對(duì)蝦；；pH脅迫；碳酸鹽堿度脅迫；RNAi

我國(guó)鹽堿水的面積高達(dá)4.6×107hm2(陳學(xué)洲等, 2020)，高pH和高堿度是鹽堿水最明顯的2個(gè)特征。調(diào)查顯示，山東東營(yíng)鹽堿水pH為8.5～9.5，碳酸鹽堿度為1.4～8.0；河北滄州鹽堿水pH為8.3～9.2，碳酸鹽堿度為3.5～13.0 (Ge, 2019)。資源豐富的鹽堿水既不能用于人畜飲用，也不能用于農(nóng)田灌溉。因此，鹽堿水養(yǎng)殖是鹽堿水開(kāi)發(fā)利用的有效途徑。pH值是養(yǎng)殖水體的重要指標(biāo)，水體pH發(fā)生變化會(huì)引起刺參(Nakai)、海灣扇貝()的應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致水生動(dòng)物死亡(韓莎等, 2018; Liu, 2020)。鹽堿水的pH值遠(yuǎn)高于正常養(yǎng)殖水體(pH為7.5～8.5) (韓旭等, 2021)，在養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的殘餌和廢料也會(huì)使水體富營(yíng)養(yǎng)化，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖水體pH值升高(Lucia, 2013; 李瑞萍等, 2015)。過(guò)高的pH會(huì)腐蝕蝦的鰓組織，使其呼吸困難，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致窒息死亡，同時(shí)會(huì)使免疫功能下降，直接或間接影響其生長(zhǎng)、繁殖和抗氧化等能力(胡碩等, 2019; 趙先銀等, 2011;王蕓等, 2013)。水體堿度一般是指水體中能與強(qiáng)酸發(fā)生中和反應(yīng)的物質(zhì)總量，主要由HCO3–、CO32–組成，稱為碳酸鹽堿度(柳飛等, 2016)。房文紅等(2000)研究表明，水體堿度與pH影響中國(guó)對(duì)蝦()幼蝦的存活率，高碳酸鹽堿度會(huì)影響中國(guó)對(duì)蝦的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。脊尾白蝦()的抱卵率、孵化率和幼體成活率等會(huì)隨著堿度的升高而降低(么宗利等, 2010、2012; 柳飛等, 2016)。上述研究表明，鹽堿水的高pH和高堿度特性是影響水生生物生長(zhǎng)存活的主要原因。近年來(lái)，凡納濱對(duì)蝦()、脊尾白蝦、羅非魚(yú)()等經(jīng)過(guò)多年鹽堿水養(yǎng)殖模式和技術(shù)的探索，已基本實(shí)現(xiàn)鹽堿水養(yǎng)殖，大大提高了鹽堿水的利用率，創(chuàng)造了較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(孫家強(qiáng), 2018; 馮偉業(yè)等, 2020)。因此，研究中國(guó)對(duì)蝦的耐鹽堿機(jī)制，為提升其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及抗逆性提供理論依據(jù)，對(duì)早日實(shí)現(xiàn)中國(guó)對(duì)蝦鹽堿水養(yǎng)殖具有重要意義。

自噬(autophagy)是細(xì)胞維持正常生理活動(dòng)及內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的一種代謝活動(dòng)，其作用機(jī)理是通過(guò)溶酶體降解來(lái)清除自身異常組分或細(xì)胞通過(guò)降解自身組分來(lái)解決外界營(yíng)養(yǎng)匱乏的問(wèn)題(Matsushita, 2007)。目前，在酵母中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40個(gè)自噬相關(guān)基因(autophagy- related gene,)(衛(wèi)亞平, 2016)，眾多自噬相關(guān)基因中，被證明是微自噬和巨自噬的重要標(biāo)志(Mizushima, 1999; 王懿崢等, 2018)，與共軛結(jié)合形成異源二倍體，后又與共價(jià)結(jié)合，形成類泛素結(jié)合系統(tǒng)，共同轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體膜上(Matsushita, 2007; 陳立德等, 2017)，參與自噬體膜的延伸和擴(kuò)張以及最終包裹內(nèi)容物形成自噬體的過(guò)程(Klionsky, 2003)，被廣泛作為研究自噬行為的對(duì)象(Simonsen, 2008; Egan, 2011; Wei, 2016)。已有研究表明，在動(dòng)植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)表達(dá)量會(huì)明顯上調(diào)，與野生型相比，過(guò)表達(dá)番茄()的耐高溫、耐旱和耐高鹽等性能均有所提高(陳立德等, 2017; 賈昕, 2018)。在哺乳動(dòng)物中，-共軛物參與小鼠()先天抗病毒免疫，促進(jìn)小鼠的殺菌作用；參與牦牛()生殖過(guò)程中卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟和早期胚胎的發(fā)育(Jounai, 2007; 王靖雷等, 2019)。在魚(yú)類中，被證明在神經(jīng)保護(hù)和先天免疫中發(fā)揮作用，且過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)自噬活動(dòng)(Hu, 2017; Chu, 2019)；斑節(jié)對(duì)蝦()在哈維氏弧菌()攻毒下，不論是干擾、單個(gè)基因或者2個(gè)基因同時(shí)干擾，其自噬水平均有所下降(劉偉, 2018)。

本課題組在中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫下自噬相關(guān)基因差異表達(dá)(未發(fā)表)，鑒于自噬基因在其他物種中的研究進(jìn)展，本研究對(duì)非生物脅迫下自噬相關(guān)基因所發(fā)揮的作用進(jìn)行驗(yàn)證。本研究通過(guò)克隆中國(guó)對(duì)蝦全長(zhǎng)基因，分析其在各組織中的表達(dá)特征及其在pH脅迫、碳酸鹽堿度脅迫下的差異表達(dá)情況并驗(yàn)證其功能，為中國(guó)對(duì)蝦在細(xì)胞自噬方面的研究提供參考，旨在為提高中國(guó)對(duì)蝦抗逆性和良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用蝦取自山東日照開(kāi)航水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，選擇健康無(wú)病、規(guī)格整齊、活力旺盛的中國(guó)對(duì)蝦進(jìn)行pH、碳酸鹽堿度脅迫及siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，所用對(duì)蝦體長(zhǎng)為(11.59±0.96) cm，體重為(21.29±2.47) g。實(shí)驗(yàn)用水為過(guò)濾后的地下海水，溫度為20℃～22℃，鹽度為26～28，pH 8.14～8.20。實(shí)驗(yàn)前將蝦置于養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)3～5 d。暫養(yǎng)期間，池中水深為30～40 cm，每天換水1/3，投喂餌料為中國(guó)對(duì)蝦體重的5%，待其適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2 組織采集

選取9尾未經(jīng)處理的健康中國(guó)對(duì)蝦，取其鰓、肝胰腺、眼柄、肌肉、胃、心臟、腸和血淋巴細(xì)胞，每3尾為1組，放入凍存管中，迅速放入液氮保存，用于后續(xù)總RNA的提取以及組織表達(dá)分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pH、碳酸鹽堿度脅迫實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pH脅迫實(shí)驗(yàn)共分為2組，pH 8.2 (自然海水)為對(duì)照組，pH 9.0為脅迫組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放入30尾中國(guó)對(duì)蝦，參照李政道(2018)和哈承旭等(2009)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用NaOH、HCl和NaHCO3調(diào)節(jié)水體pH值。脅迫實(shí)驗(yàn)在60 L的整理箱中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前48 h調(diào)好水體pH值，當(dāng)水體穩(wěn)定后，將蝦放入整理箱中開(kāi)始脅迫實(shí)驗(yàn)。pH脅迫實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第0、3、6、12、24、48、72、96 h分別從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)挑選9尾蝦，取其鰓組織，迅速放入液氮中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中總RNA的提取。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每3 h測(cè)一次水體pH值并校正。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將碳酸鹽堿度脅迫實(shí)驗(yàn)分為 2組，堿度3.2 (自然海水)為對(duì)照組，堿度11為脅迫組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放入30尾中國(guó)對(duì)蝦。參照柳飛(2016)和房文紅等(2000)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，碳酸鹽堿度脅迫實(shí)驗(yàn)使用Na2CO3和NaHCO3調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)水體堿度，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl進(jìn)行微調(diào)，實(shí)驗(yàn)在60 L的整理箱中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前48 h調(diào)好水體堿度，當(dāng)水體堿度穩(wěn)定后將蝦放入整理箱中開(kāi)始脅迫實(shí)驗(yàn)。碳酸鹽脅迫實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第0、3、6、12、24、48、72、96小時(shí)分別從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取出9尾蝦，取其鰓組織，迅速放入液氮中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中總RNA的提取。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每3 h測(cè)1次水體堿度并校正，采用雙指示劑滴定法(酚酞和甲基橙作為指示劑)測(cè)定堿度。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 先將收集的樣品進(jìn)行預(yù)處理，體積較大的，如肌肉、肝胰腺，采用液氮研磨法處理，其他體積較小的樣品用低溫勻漿機(jī)處理。將處理好的樣品分裝至無(wú)RNA酶的離心管中，每管裝樣品80～100 mg，加入1 mL TransZol Up，每個(gè)組織取1管分裝好的樣品使用總RNA提取試劑盒(全式金，北京)提取總RNA，將提取的總RNA放入–80℃保存?zhèn)溆?。使用超微量紫外分光光度?jì)(Thermo, 美國(guó))測(cè)定RNA質(zhì)量和濃度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。使用SMARTer?RACE 5′/3′ (寶生物，大連)試劑盒合成中國(guó)對(duì)蝦3′、5′RACE模板，用于基因克隆，–80℃保存。

1.3.3 中國(guó)對(duì)蝦基因克隆 從中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組中篩選自噬相關(guān)基因的EST序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到中間片段，并使用DNAMAN軟件對(duì)其驗(yàn)證。以驗(yàn)證后的序列為模板，設(shè)計(jì)RACE引物，進(jìn)行RACE擴(kuò)增。將RACE擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T1載體(全式金，北京)后轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(全式金，北京)中，挑取單克隆菌株進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定，通過(guò)菌液PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，選出陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序。使用軟件Contig Express拼接菌液測(cè)序結(jié)果，得到5′和3′端擴(kuò)增序列；使用在線軟件ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找的開(kāi)放閱讀框。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI中的Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)區(qū)域，對(duì)核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，使用Protein Blast比對(duì)與其他物種自噬相關(guān)基因的同源性。使用DNAMAN軟件進(jìn)行多生物氨基酸序列對(duì)比。使用MEGA 7軟件構(gòu)建N-J進(jìn)化樹(shù)。使用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，使用TMHMM Server v. 2.0軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，使用ExPASy中ProtParam tool預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)特性，使用ExPASy中ProtScale推測(cè)蛋白質(zhì)親水性，使用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽。

1.3.5基因siRNA干擾實(shí)驗(yàn) 根據(jù)基因cDNA序列，設(shè)計(jì)3個(gè)干擾靶點(diǎn)，分別編號(hào)為ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3 (表2)，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。以注射無(wú)意義雙鏈siRNA-NC為陰性對(duì)照組，以分別注射ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3作為干擾組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放入10尾蝦，注射siRNA前稱量蝦的重量，根據(jù)蝦體重來(lái)調(diào)整注射量(1 μg/g)，注射部位為第2腹節(jié)肌肉，注射完成后放入裝有正常海水的60 L整理箱中。注射后24 h，每組中隨機(jī)選取3尾蝦，檢測(cè)干擾后基因在鰓中的表達(dá)變化，選出干擾效果最好的靶點(diǎn)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。siRNA干擾正式實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：在pH 9.0、碳酸鹽堿度11.0脅迫下，注射無(wú)意義雙鏈siRNA-NC作為2個(gè)對(duì)照組，以注射效果最佳的靶點(diǎn)作為2個(gè)干擾組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后統(tǒng)計(jì)脅迫48 h死亡率。

表1 本研究所用引物

Tab.1 The primers used in this research

表2 本研究所用siRNA序列與NC序列

Tab.2 The sequences of siRNA and NC used in this research

1.3.6基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量分析 利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物FcATG5-F1和FcATG5-R1(表1)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (諾唯贊，南京)將待測(cè)樣品RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用ChamQTMSYBR?Color qPCR master mix試劑盒(諾唯贊，南京)和7500 Real Time PCR System儀器(ABI，美國(guó))檢測(cè)中國(guó)對(duì)蝦各組織表達(dá)分布及其在pH脅迫、碳酸鹽堿度脅迫下的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果使用2–ΔΔCt方法計(jì)算得出相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，運(yùn)用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用OriginPro 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FcATG5基因序列分析

通過(guò)RACE技術(shù)得到中國(guó)對(duì)蝦基因序列，全長(zhǎng)為2224 bp，將其命名為(GenBank登錄號(hào)：MW426527)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?10 bp，5′端非編碼區(qū)107 bp，3′端非編碼區(qū)307 bp，編碼269個(gè)氨基酸(圖1)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)cATG5不包含信號(hào)肽。預(yù)測(cè)其編碼的蛋白分子量為31.103 kDa，理論等電點(diǎn)為5.59，親水性平均值為–0.407，不穩(wěn)定性指數(shù)為43.43，表明該基因編碼的蛋白為疏水性不穩(wěn)定蛋白，SMART軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其具有1個(gè)APG5自噬相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 FcATG5基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用DNAMAN軟件將FcATG5氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對(duì)。結(jié)果顯示，中國(guó)對(duì)蝦FcATG5與凡納濱對(duì)蝦的同源性最高，為98.14%，與斑節(jié)對(duì)蝦的同源性為97.77%，與三疣梭子蟹()、日本沼蝦()、藍(lán)蟹()的同源性分別為85.50%、81.04%、78.32%(圖2)。

使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)(圖3)。從圖3可以看出，進(jìn)化樹(shù)分為兩大支，第一支為節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)，第二支為脊索動(dòng)物門(mén)(Chordata)。其中，中國(guó)對(duì)蝦隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱(Crustacea)，屬于第一支，與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦首先聚為一支，其次為三疣梭子蟹、藍(lán)蟹。

2.3 FcATG5基因組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)在中國(guó)對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，基因在中國(guó)對(duì)蝦各個(gè)組織中均有表達(dá)，但其在不同組織中的表達(dá)量不同，在肌肉中的表達(dá)量最高，其次在胃、眼柄中表達(dá)較高，在血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量最低(圖4)。

2.4 pH、碳酸鹽堿度脅迫下FcATG5基因在中國(guó)對(duì)蝦鰓組織中的表達(dá)分析

鰓作為水生動(dòng)物的呼吸器官，與養(yǎng)殖水體直接接觸，受水體pH、堿度等水體主要指標(biāo)變化影響較大，也是水生動(dòng)物調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和維持內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)器官。因此，本研究以中國(guó)對(duì)蝦鰓組織為主要研究對(duì)象。

pH脅迫3 h，基因在中國(guó)對(duì)蝦鰓組織中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(<0.05)；在脅迫后96 h內(nèi)，的表達(dá)呈現(xiàn)多峰式變化。脅迫后96 h，最高，為對(duì)照組的2.67倍；在48 h表達(dá)量相對(duì)最低，為對(duì)照組的1.68倍(圖5)。

圖1 FcATG5基因cDNA序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列

預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框內(nèi)核苷酸序列用大寫(xiě)字母表示，位于氨基酸序列下方；起始密碼子(ATG)為下方劃紅線區(qū)域，終止密碼子(TGA)上方標(biāo)有星號(hào)(*)

Nucleotide sequences in the predicted open reading frame are represented in capital letters below the amino acid sequence. The start codon (ATG) is the red line below, and the stop codon (TGA) is marked with an asterisk (*) above it

圖2 FcATG5基因與多種生物氨基酸序列比對(duì)

圖3 基于中國(guó)對(duì)蝦FcATG5氨基酸序列構(gòu)建的Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)

圖4 FcATG5在中國(guó)對(duì)蝦各組織中的表達(dá)

G：鰓；HE：肝胰腺；ET：眼柄；M：肌肉；S：胃；H：心臟；I：腸；HL：血淋巴細(xì)胞；柱上不同字母代表表達(dá)差異顯著(<0.05)。下同

G: Gill; HE: Hepatopancreas; ET: Eye stalk; M: Muscle; S: Stomach; H: Heart; I: Intestines; HL: Hemolymph cells. Different letters on the column represent significant differences (<0.05). The same as below

與對(duì)照組相比，碳酸鹽堿度脅迫下在鰓組織中的表達(dá)變化呈顯著升高趨勢(shì)(<0.05)，。脅迫后96 h內(nèi)，的表達(dá)基本呈先上調(diào)再下調(diào)的變化趨勢(shì)，在脅迫后12 h達(dá)到最高，為對(duì)照組的2.77倍；在96 h表達(dá)量最低，為對(duì)照組的1.30倍(圖6)。

圖5 pH脅迫下FcATG5基因在鰓中的相對(duì)表達(dá)

*：與對(duì)照相比，表達(dá)差異顯著(<0.05)。下同

*: Significant difference compared with control (<0.05). The same as below

2.5 FcATG5基因的功能驗(yàn)證分析

2.5.1 siRNA干擾靶點(diǎn)篩選 siRNA干擾后，基因在中國(guó)對(duì)蝦鰓中的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示。與對(duì)照組相比，注射不同干擾試劑24 h時(shí)，基因在鰓中的表達(dá)量呈顯著降低的趨勢(shì)(<0.05)。注射ATG5-1 24 h時(shí)，基因表達(dá)量為對(duì)照組的0.516倍；注射ATG5-2 24 h時(shí)，基因表達(dá)量為對(duì)照組的0.617倍；注射ATG5-3 24 h時(shí)，基因表達(dá)量為對(duì)照組的0.174倍。經(jīng)比較，ATG5-3干擾效果最好，干擾效果達(dá)到82.6%，選擇干擾靶點(diǎn)ATG5-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 碳酸鹽堿度脅迫下FcATG5基因在鰓中的表達(dá)

圖7 注射ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3 24 h時(shí)FcATG5基因在鰓中的表達(dá)

2.5.2 pH、碳酸鹽脅迫下干擾基因中國(guó)對(duì)蝦死亡率 向中國(guó)對(duì)蝦注射基因siRNA干擾試劑ATG5-3，并對(duì)其進(jìn)行pH脅迫，統(tǒng)計(jì)其0～48 h內(nèi)的死亡率，結(jié)果如圖8所示。干擾組在0～48 h的累計(jì)死亡率(50%)顯著高于對(duì)照組(33.33%) (<0.05)。其中，0～12 h干擾組死亡率為8.33%，對(duì)照組為0；12～24 h干擾組死亡率為25%，對(duì)照組為8.33%。

向中國(guó)對(duì)蝦注射基因siRNA干擾試劑ATG5-3，并對(duì)其進(jìn)行高堿度脅迫，統(tǒng)計(jì)其0～48 h內(nèi)的死亡率，結(jié)果如圖9所示。干擾組在0～48 h的累計(jì)死亡率(59.09%)顯著高于對(duì)照組(41.18%) (<0.05)。其中，0～12 h干擾組死亡率為9.09%，對(duì)照組為11.76%；12～24 h干擾組死亡率為31.82%，對(duì)照組為17.65%。

圖8 pH 9.0脅迫注射干擾的中國(guó)對(duì)蝦累計(jì)死亡率

圖9 碳酸鹽堿度11脅迫注射干擾的中國(guó)對(duì)蝦累計(jì)死亡率

3 討論

本研究運(yùn)用RACE技術(shù)首次克隆得到中國(guó)對(duì)蝦基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，基因與其他物種，如太平洋鱈()(孫航等, 2015)、斑節(jié)對(duì)蝦(劉偉, 2018)的基因的預(yù)測(cè)結(jié)果相同或相似。開(kāi)放閱讀框編碼的氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦等物種具有較高的同源性，且包含1個(gè)自噬相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域APG5，這表明基因所編碼的蛋白具有高度保守性。

中國(guó)對(duì)蝦基因的組織特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，基因在各組織中均有表達(dá)，無(wú)組織特異性，但在各組織中表達(dá)量差異性顯著，其中，在肌肉中表達(dá)量最高，在血淋巴細(xì)胞中表達(dá)最低，這與劉偉(2018)的研究結(jié)果一致。鰓是水生動(dòng)物的呼吸器官，與養(yǎng)殖水體直接接觸，受水體pH、堿度等水體主要指標(biāo)變化影響較大，也是水生動(dòng)物調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和維持內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)器官。在pH和碳酸鹽堿度脅迫下，鰓作為主要的響應(yīng)器官，在維持機(jī)體生理功能中發(fā)揮積極調(diào)控作用，而細(xì)胞自噬是免疫調(diào)控的重要部分，在水生動(dòng)物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用(張小明, 2018; Li, 2018; 何麗等, 2019; 洋雯, 2019)。因此，推測(cè)在中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)對(duì)pH、碳酸鹽脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。研究自噬基因在中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫的機(jī)理，對(duì)于豐富中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫基礎(chǔ)性研究尤為重要。

研究表明，基因不僅能促進(jìn)細(xì)胞自噬的形成，而且可以刺激細(xì)胞凋亡，在動(dòng)物的先天免疫、神經(jīng)保護(hù)、生殖發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Jounai, 2007; 王靖雷等, 2019)。作為細(xì)胞自噬的重要標(biāo)志(Mizushima,1999; 王懿崢等, 2018)，根據(jù)其表達(dá)量的變化可推測(cè)細(xì)胞自噬水平的變化。本研究結(jié)果顯示，pH、碳酸鹽堿度脅迫下，中國(guó)對(duì)蝦鰓中表達(dá)量均有所升高，pH脅迫后96 h達(dá)到最高，碳酸鹽堿度脅迫后12 h達(dá)到最高，這與哈維氏弧菌刺激下，斑節(jié)對(duì)蝦中表達(dá)量上調(diào)，在72 h達(dá)到最高的研究結(jié)果相似(劉偉, 2018)。由此推測(cè)，鰓作為調(diào)節(jié)滲透壓、維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要器官，在響應(yīng)pH、碳酸鹽堿度脅迫時(shí)，其細(xì)胞自噬活動(dòng)增強(qiáng)，且分別在脅迫后96 h和12 h達(dá)到最高水平。

RNA干擾技術(shù)是由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，研究人員通常利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因功能的探索。已有研究表明，干擾會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平下降，而對(duì)進(jìn)行過(guò)表達(dá)處理則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞自噬，這揭示了對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用(劉偉, 2018; Chu, 2019)。研究表明，沉默癌細(xì)胞中基因可以提高化療藥物對(duì)癌癥的治療效果(Egan, 2011; Simonsen, 2008; Wei, 2016)；對(duì)斑馬魚(yú)()進(jìn)行過(guò)表達(dá)處理，可以減輕或者逆轉(zhuǎn)帕金森氏病的病理特征(Hu, 2017)；沉默斑節(jié)對(duì)蝦中會(huì)使斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞自噬水平下降(劉偉, 2018)。RNA干擾結(jié)果顯示，沉默會(huì)使中國(guó)對(duì)蝦死亡率升高，表明在pH、碳酸鹽堿度脅迫下，表達(dá)量越低，中國(guó)對(duì)蝦對(duì)非生物脅迫的耐受力越差，其存活率就越低。推測(cè)原因?yàn)槌聊?，其表達(dá)量下降，進(jìn)而抑制了細(xì)胞自噬水平，降低了中國(guó)對(duì)蝦的免疫力及抗逆性。這一結(jié)果與上述沉默動(dòng)物或癌細(xì)胞中的相關(guān)研究結(jié)果相似。

非生物脅迫下，中國(guó)對(duì)蝦體內(nèi)積累大量活性氧中介物(ROS)，使得機(jī)體受到氧化損傷，導(dǎo)致線粒體核糖體蛋白等受到損傷，產(chǎn)生功能性障礙(Li, 2021)。自噬相關(guān)基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程來(lái)清除體內(nèi)受損傷的細(xì)胞器和老化、錯(cuò)誤折疊蛋白等，也可通過(guò)降解自身組分來(lái)解決外界營(yíng)養(yǎng)匱乏的問(wèn)題，維持機(jī)體內(nèi)部相對(duì)穩(wěn)態(tài)(高婷等, 2018)，由此推測(cè)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬水平來(lái)清除由于非生物脅迫而受損傷的線粒體及蛋白質(zhì)等。此外，自噬通過(guò)對(duì)葡萄糖的攝取、糖酵解關(guān)鍵酶和線粒體的調(diào)控來(lái)參與糖代謝過(guò)程(楊照國(guó)等, 2015)。中國(guó)對(duì)蝦在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)機(jī)體耗能增加，糖代謝活動(dòng)增強(qiáng)(He, 2019)，由此推測(cè)，自噬基因可能通過(guò)此路徑為機(jī)體在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)供能，從而降低中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)的死亡率。本研究對(duì)在非生物脅迫中的作用進(jìn)行了初步驗(yàn)證，但其對(duì)細(xì)胞自噬過(guò)程的調(diào)控機(jī)制以及其所在自噬通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步研究。

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Cloning ofGene ofand Expression Analysis under pH and Carbonate Alkalinity Stress

WEI Wei1,2, HE Yuying2, LI Zhaoxia1①, ZHOU Yuxin3, LI Jian2, XIE Yongjun4

(1. School of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266237,China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071,China; 3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China; 4. Hebei Provincial General Station of Aquatic Products and Fishery Environmental Monitoring and Protection, Shijiazhuang, Hebei 050011,China)

The full-length cDNA ofinwas cloned using rapid amplification of cDNA end (RACE) technology and named. The tissue expression ofand its expression characteristics under pH and carbonate alkalinity stress were analyzed using quantitative PCR. The function ofwas verified using RNAi. Gene analysis showed that thegene cDNA consisted of 2225 bp with an open reading frame of 810 bp, encoding 269 amino acids, and has a predicted protein molecular weight of 31.103 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.59. It is a hydrophobin, contains an autophagy-related protein domain (APG5), has no transmembrane structure, and does not contain signal peptides. The homology and phylogenetic analysis showed thatwas highly conserved and had the highest homology with, reaching 98.14%. The tissue expression analysis showed thatwas expressed in all tissues of, with the highest expression in muscle, and the lowest expression in blood lymphocyte (<0.05). The expression level ofin the gill tissue was the highest at 96 h after pH stress, 2.67 times higher than that of the control group, and was the lowest at 48 h, which was 1.68 times higher than that of the control group. The expression level ofin the gill tissue was the highest at 12 h after the carbonate alkalinity stress, 2.77 times higher than that of the control group, and was the lowest at 96 h, which was 1.30 times higher than that of the control group. The results of the interference experiments showed that under pH and carbonate alkalinity stress, silencing thegene significantly increased the mortality of(<0.05), indicating that the higher the expression of this gene, the higher the survival rate of. The results of the study showed that the expression ofwas significantly increased under pH and carbonate stress (<0.05). It is speculated that autophagy may be involved in the regulation ofin response to abiotic stress. The results of this study are an important reference for the study of autophagy in aquatic animals, especially crustaceans, and will help advance the research of Chinese shrimp in saline-alkaline aquaculture systems.

;; pH stress; Carbonate alkalinity stress; RNAi

S917.4

A

2095-9869(2022)03-0084-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210306001

http://www.yykxjz.cn/

魏威, 何玉英, 李朝霞, 周雨欣, 李健, 謝擁軍. 中國(guó)對(duì)蝦基因的克隆及其在pH、碳酸鹽堿度脅迫下的表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(3): 84–94

WEI W, HE Y Y, LI Z X, ZHOU Y X, LI J, XIE Y J. Cloning ofgene ofand expression analysis under pH and carbonate alkalinity stress. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 84–94

LI Zhaoxia, E-mail: zhx-l@163.com

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31772842)、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020TD46)、山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019QYTPY022)和中央提前下達(dá)漁業(yè)成品油價(jià)格改革財(cái)政補(bǔ)貼項(xiàng)目(326-0501-YZN-Z4HB)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31772842), China Agriculture Research System of MOF and MARA, Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46), Key Research and Development Program of Shandong Province (2019QYTPY022), and Central Government Issued the Financial Subsidy Project of Fishery Product Oil Price Reform in Advance (326-0501-YZN-Z4HB)]. 魏 威，E-mail: weiwei19960123@163.com

李朝霞，教授，E-mail: zhx-l@163.com

2021-03-06,

2021-04-04

(編輯 馮小花)