李玉萍 田晶晶 張 凱 夏 耘 王廣軍 郁二蒙 李志斐 龔望寶 謝 駿

皇竹草粉對草魚幼魚生長、抗氧化反應和腸道健康的影響*

李玉萍1,2田晶晶2張 凱2夏 耘2王廣軍2郁二蒙2李志斐2龔望寶2謝 駿2①

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所 農業(yè)農村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室 廣東 廣州 510380)

為評估皇竹草(Roxb)粉對草魚()幼魚生長、抗氧化和腸道健康的影響，配制3組分別含0% (對照組C)、10%和20%皇竹草粉(P1和P2)的等氮等能半精制飼料(蛋白質水平為36%，脂肪水平為9%)，飼喂草魚稚魚[(28.51±0.04) g] 56 d。結果顯示，相比C組，P1和P2組顯著提高了草魚幼魚的增重率和成活率(<0.05)；P2組草魚血清丙二醛(MDA)含量比C組草魚顯著降低(<0.05)；P1和P2組草魚血清中谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性比C組草魚顯著降低(<0.05)；P1和P2組的草魚血清中補體C3和C4的含量顯著提高(<0.05)；同時，這2組肝臟的3-羥酰輔酶A脫氫酶(HOAD)和細胞色素C氧化酶(COX)的活性也顯著高于C組(<0.05)；腸道顯微結構顯示，P1和P2組顯著提高了草魚幼魚腸道的絨毛高度和皺褶深度，降低了肌層厚度(<0.05)；基因表達層面，相比C組，P1和P2組下調了腸道促炎細胞因子腫瘤壞死因子α ()和白細胞介素1β ()的基因相對表達量。綜上所述，飼料中添加一定量的皇竹草粉能增強草魚幼魚的生長，降低體內氧化應激和腸道炎癥。

草魚；皇竹草；生長性能；腸道發(fā)育；腸炎

草魚()為中國“四大家魚”之一，廣泛分布于我國淡水水域，具有生長快、飼料成本低、蛋白利用率高等優(yōu)點(馬貴華等, 2008)。草魚是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水魚類，據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計，2019年，我國草魚總產(chǎn)量為553.30萬t，占養(yǎng)殖淡水魚總產(chǎn)量的21% (于秀娟等, 2020)。隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化和集約化的快速發(fā)展，養(yǎng)殖草魚因飼料的不均衡等因素的影響導致魚體免疫力下降，在應激狀態(tài)下易爆發(fā)一系列的疾病，包括草魚出血病、腸炎、爛鰓和赤皮病等，對養(yǎng)殖生產(chǎn)造成嚴重的影響(陳繼楚等, 2020)。鑒于國家對抗生素等藥物濫用的控制，通過綠色飼料學途徑提高草魚機體抗病力是未來養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。

在自然環(huán)境中，草魚生長到特定規(guī)格(5.5 cm左右)后就以各種草類作為食物的主要來源(He, 2015)。從進化的角度來看，青草類飼料應該是最符合草魚營養(yǎng)需求且有益于草魚機體健康的食物來源。然而，當前商用草魚配合飼料中幾乎不添加青草類飼料原料(葉元土等, 2013)。有研究表明，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式中采用青飼料與配合飼料搭配投喂草魚，顯示出促草魚生長、提高草魚成活率、增加養(yǎng)殖經(jīng)濟效益等特點 (張耀武等, 2007; 段小明等, 2008; 朱慶紅等, 2009; 李建光等, 2012)。在其他魚類中，如飼料中添加大蒜(L.)莖粉和牛至(L)草粉能提高鏡鯉()血清溶菌酶活性、C3和C4活性等非特異免疫性能(徐奇友等, 2010)，基礎飼料中添加7.5%杜仲(Oliver)葉粉能顯著促進青魚魚種的生長性能，并提高免疫球蛋白M、補體C3等非特異免疫基因的表達(許友卿等, 2015)。這些結果提示，飼料中添加青草類飼料不僅有益于草食性魚類，且對雜食性和肉食性魚類免疫力的提升都有正面效果。推測與人攝食有益于健康的膳食纖維類似(劉劼等, 2020)。由此，在魚飼料制作的過程中，應考慮青草類飼料的添加。另一方面，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及飼料用糧食的貿易風險，發(fā)展含青草類的草魚飼料也是當前飼料產(chǎn)業(yè)的一個重要選擇。然而，鑒于青草分為很多種類，產(chǎn)量、營養(yǎng)成分及飼料制作工藝也存在差異，很難判斷哪種青草類飼料有益于魚體健康并適用于魚飼料中，因此，大量相關的評估工作亟待展開。

皇竹草(Roxb)為多年生禾本科植物，由象草()和美洲狼尾草()雜交選育而成，屬四碳植物(夏先玖, 1999)，具有產(chǎn)量高、競爭力強、易栽易管、生長快、抗逆性強和營養(yǎng)豐富等特點，廣泛分布于熱帶與亞熱帶，在廣東、廣西、海南等地區(qū)產(chǎn)量較高(古輝輝等, 2019)。由于皇竹草葉質柔軟，莖葉脆嫩多汁，適口性好，可用作多種動物(豬、牛、雞、鵝、魚等)的飼料，表現(xiàn)出較高的飼料利用率 (于凌云等, 2013)，是一種新型高效經(jīng)濟作物，被譽為“牧草之王”(唐式校等, 2006)。研究表明，皇竹草含19種氨基酸，其中，賴氨酸、礦物質和維生素等的含量較高，可以滿足魚類生長發(fā)育的需要(丁翠華, 2008; 吳斌等, 2018)。楊明富(2003)指出，不論是鮮草，還是青貯或風干加工成草粉，皇竹草都是飼養(yǎng)各種草食性魚類的好飼料。本團隊前期發(fā)現(xiàn)，單純投喂皇竹草的草魚具有出肉率高、體型好等優(yōu)點(毛東東等, 2018)。在廣東，已經(jīng)有企業(yè)將皇竹草制成草粉在魚飼料中添加，然而，皇竹草粉對草魚的健康影響如何，目前還不明確。為此，本研究以草魚幼魚為研究對象，在半精制飼料的基礎上評估皇竹草粉對草魚的生長及健康的影響，重點關注抗氧化與腸道健康相關指標，為皇竹草粉作為水產(chǎn)類飼料原料的應用提供理論依據(jù)和基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗用皇竹草粉購自廣東省江門市鶴山廣佛飼料廠。參考Lovell (1989)中的飼料配方，以酪蛋白和明膠為蛋白源，魚油和大豆油為脂肪源，設置3組蛋白質水平為33%、脂肪水平為9%的等氮等能半精制飼料。對照組(C)不做處理，處理組分別添加10%和20%皇竹草粉(P1和P2)，每組添加0.1%二丁基羥基甲苯作為抗氧化劑(表1)。飼料制備前先將飼料原料粉碎，過60目篩。按比例準確稱取飼料原料，按照含量從小到大的原則逐級混合，然后再將脂肪源和水分別混入，搓勻。將混合均勻的原料用飼料制粒機擠壓成2.0 mm粒徑的顆粒飼料，在陰涼處風干后放在–20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 飼養(yǎng)與管理

實驗用魚購自廣東佛山市南海通威水產(chǎn)科技有限公司，養(yǎng)殖實驗在中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地進行。實驗魚先放于4.5 m×4.5 m×1.1 m的水泥池中暫養(yǎng)14 d，以對照組飼料對草魚進行馴食。暫養(yǎng)結束后，挑選規(guī)格均一、體格健壯的草魚198尾[(28.51±0.04)g]分配到9個養(yǎng)殖缸(1.2 m×0.6 m× 0.5 m)中，每個養(yǎng)殖魚缸22尾。每組飼料隨機投喂 3個養(yǎng)殖缸，實驗周期為56 d，每天08:30和16:30各投喂1次。養(yǎng)殖期間，飼喂采用飽食投喂，每天記錄進食量、水溫、天氣和死亡情況，期間水體pH為6.5～7.8，溶氧量(DO)為5.7～7.6 mg/L，氨氮濃度≤0.20 mg/L，水溫為28.0℃～33.0℃。

1.3 采樣與處理

表1 實驗飼料組成及成分

Tab.1 Formulation and chemical composition of the experimental diets

注：1: 二丁基羥基甲苯：簡稱BHT，抗氧化劑；2: 混合維生素無機物：硫酸鋁鉀1.59 g/kg，碳酸鈣181.01 g/kg，磷酸二氫鈣116.01 g/kg，氯化鈷0.7 g/kg，硫酸鎂52.16 g/kg，硫酸錳0.07 g/kg，氯化鉀165.53 g/kg，碘化鉀0.14 g/kg，碳酸鋅1.92 g/kg，磷酸二氫鈉136.05 g/kg，硒酸鈉0.06 g/kg，硫酸銅0.75 g/kg，檸檬酸鐵13.38 g/kg；硫胺素50 mg/kg，核黃素50 mg/kg，維生素A 25 000 IU/kg，維生素E 400 IU/kg，維生素D324 000 IU/kg，甲萘醌40 mg/kg，鹽酸吡哆醇40 mg/kg，氰鈷胺0.1 mg/kg，生物素6 mg/kg，泛酸鈣100 mg/kg，葉酸15 mg/kg，煙酸200 mg/kg，肌醇2000 mg/kg

Note: 1: Dibutyl hydroxytoluene: BHT for short, antioxidant; 2: Mixed vitamin inorganics: Aluminium potassium sulfate 1.59 g/kg, calcium carbonate 181.01 g/kg, calcium dihydrogen phosphate 116.01 g/kg, cobalt chloride 0.7 g/kg, magnesium sulfate 52.16 g/kg, manganese sulfate 0.07 g/kg, potassium chloride 165.53 g/kg, potassium iodide 0.14 g/kg, zinc carbonate 1.92 g/kg, sodium dihydrogen phosphate 136.05 g/kg, sodium selenate 0.06 g/kg, copper sulfate 0.75 g/kg, citric acid Iron 13.38 g/kg; thiamine 50 mg/kg, riboflavin 50 mg/kg, vitamin A 25 000 IU/kg, vitamin E 400 IU/kg, vitamin D324 000 IU/kg, menadione 40 mg/kg, hydrochloric acid Pyridoxine 40 mg/kg, cyanocobalamin 0.1 mg/kg, biotin 6 mg/kg, calcium pantothenate 100 mg/kg, folic acid 15 mg/kg, nicotinic acid 200 mg/kg, and inositol 2000 mg/kg

養(yǎng)殖結束后停食24 h，對所有魚進行采樣。采樣前先用MS222麻醉，進而測量體重和體長。從每個魚缸中隨機選取6尾草魚，在工作臺上，用1 mL無菌注射器從尾靜脈取血，裝于1.5 mL無菌離心管中，4℃靜置過夜后3500 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝于1.5 mL無菌離心管中，并保存在–80℃冰箱，用于血清指標測定。另隨機取9尾草魚進行解剖。其中，中腸和肝臟迅速置于液氮中凍存，進而轉移到–80℃超低溫冰箱冷凍保存，用于肝臟生化指標測定和RNA提取。隨機挑選3尾魚采集長度約1 cm的中腸，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于組織切片。實驗魚的增重率(weight gain rate, WGR, %)、成活率(survival rate, SR, %)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio, FCR)、攝食率(feeding ratio, FR, %/d)計算公式如下：

WGR=100×(W–W)/W；

SR=100×N/N；

FCR=/(W–W)；

FR=100×/(W/2+W2)/；

式中，W為初始體重(g)；W為終末體重(g)；N為終末尾數(shù)；N為初始尾數(shù)；為攝入飼料總量(g)；為飼養(yǎng)天數(shù)(d)。

1.4 血清與肝臟生化指標和酶活性的測定

血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙二醛(malondialdehyde, MAD)、補體3(complement 3, C3)、補體4(complement 4, C4)等指標測定使用試劑盒檢測(南京建成生物科技有限公司)，操作步驟均按照試劑盒說明書進行。

肝臟的魚3–羥酰輔酶A脫氫酶(fish 3-hydroxyacyl- CoA dehydrogenase, HOAD)和魚細胞色素C氧化酶(fish cytochrome c oxidase, COX)的測定使用試劑盒進行，并參照說明書進行具體操作。HOAD和COX試劑盒購于上海酶聯(lián)生物有限公司。

1.5 組織切片

將固定的腸道組織樣品在自來水中洗滌12 h，然后在一系列梯度乙醇中進行脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%兩次)。根據(jù)先前描述的標準組織學技術，將樣品在二甲苯中平衡并包埋在石蠟中(Yu, 2017)。用旋轉切片機(萊卡RM2235，德國)切割為5 μm的切片。中腸腸道組織采用蘇木精–伊紅(hematoxylin- eosin staining, H&E)染色。使用立式顯微鏡(Leica biosystems, Wetzlar, 德國)觀察組織學樣品并拍照。

1.6 腸道組織免疫相關基因表達量測定

1.6.1 總RNA的提取 中腸腸道組織總RNA采用TRIZOL試劑盒(TaKaRa, 日本)提取，并用1%瓊脂糖變性膠來檢測總RNA的提取質量和完整性。除去總RNA中的DNA后，利用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒(TaKaRa, 日本)，以1 μg總RNA為模板，37℃ 15 min，85℃反應5 s，4℃結束，反轉錄合成cDNA。cDNA保存在–20℃用于基因檢測。

1.6.2 實時定量PCR 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是通過LightCycler?96—TimePCR Detection System (Roche, 瑞士)來完成的，所用的qRT-PCR試劑是Power SYBR?Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, 美國)。qRT-PCR反應的總體積為20 μL，包括：上下游引物各0.6 μL，1.0 μL稀釋的第一鏈cDNA產(chǎn)物，10 μL 2×Power SYBR?Green PCR Master Mix和7.8 μL滅菌雙蒸餾水。循環(huán)參數(shù)如下：50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR反應后，熔解曲線為72℃～95℃的范圍內進行分析(以1℃/20 s的步長)以確認單個產(chǎn)物。qRT-PCR中檢測的基因的引物是通過已經(jīng)發(fā)表的草魚β-肌動蛋白(β-actin)、腫瘤壞死因子α ()和白細胞介素1β ()序列基礎上設計的，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表2)。相關基因的相對表達水平是以β-actin基因的表達為參照，運用比較CT方法(2–ΔΔCt)計算基因表達值(Livaka, 2001)。所有的RNA樣品都設置3個重復進行檢測。

1.7 數(shù)據(jù)計算與分析

所有的數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，實驗所獲得各項數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差(one-way ANOVA)分析，差異顯著時，采用Duncan’s進行多重比較，<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚生長性能及飼料利用的影響

經(jīng)56 d的養(yǎng)殖實驗，飼料中添加皇竹草粉對草魚生長性能的影響見表3。結果顯示，與對照組(C組)比較，10%皇竹草粉組(P1組)與20%皇竹草粉組(P2組)的增重率分別提高了10.85%和17.18% (<0.05)，成活率提高了19.50%和23.69% (<0.05)，飼料系數(shù)分別降低10.69%和12.07%，攝食率提高6.25%和4.86%，但均無顯著性差異(>0.05)。

2.2 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚血清生化、抗氧化和免疫相關指標的影響

由圖1a、圖1b可知，飼料中添加皇竹草粉顯著降低草魚血清中AST和ALT的活性(<0.05)。P2組的MDA含量顯著低于C組(<0.05)(圖1c)。P1組和P2組的補體C3和C4含量顯著高于C組(<0.05) (圖1d、圖1e)。

2.3 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚肝臟細胞活性相關指標的影響

如圖2a、圖2b所示，與C組相比，P1和P2組顯著增加了草魚肝臟HOAD和COX的活性(<0.05)。

2.4 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚腸道的組織學觀察

從腸道顯微結構(圖3)中可以看出，相比對照組，飼料中添加皇竹草粉后促進了中腸腸道絨毛的發(fā)育，絨毛高度與皺褶深度有所增加，但肌層厚度有所下降。表4顯示，飼料中添加皇竹草粉顯著提高草魚幼魚中腸腸道絨毛高度和皺褶深度，降低了腸道肌層厚度(<0.05)。

表2 實時熒光定量PCR中基因的引物

Tab.2 Primers used in quantitative real-time PCR

表3 飼料中皇竹草粉對草魚幼魚生長和飼料利用的影響

Tab.3 Effects of diets supplemented with P. sinese Roxb meal on growth performance and feed utilization of juvenile grass carp (n=3)

注：同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)，標有相同字母或無字母表示差異不顯著(>0.05)，下同

Note: In the same column, values with different small letter superscripts are significantly different (<0.05), while with same small letter or no superscripts mean no significant difference (>0.05), the same as below

圖1 飼料中添加皇竹草粉對草魚幼魚血清生理生化指標的影響(n=3)

不同小寫字母表示數(shù)據(jù)間有顯著的統(tǒng)計學差異(<0.05)；C：對照組；P1：10%皇竹草粉組；P2：20%皇竹草粉組，下同

Different lowercase letters indicate statistically significant differences between the data (<0.05); C: Control group; P1: 10% grass meal group; P2: 20% grass meal group, the same as below

2.5 基因表達定量分析

飼料中添加皇竹草粉對草魚中腸炎癥相關基因表達的影響見圖4。與C組相比，P1組和P2組的促炎因子和的基因的相對表達水平顯著降低(<0.05)。

3 討論

3.1 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚生長性能的影響

本研究中飼料添加皇竹草粉提高了草魚的生長性能，可能草魚對植物性飼料原料有天然的需求。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂植物性餌料浮萍(L.)的草魚生長發(fā)育速度明顯快于飼喂動物性餌料搖蚊幼蟲()的草魚(張杏波等, 2012)。黃飛等(2008)研究指出，草粉可促進腸道發(fā)育，降低腸道pH值，促進有益菌群的繁殖，這些有益菌能產(chǎn)生一系列有益于生長和健康的揮發(fā)性脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等。He等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，草魚在食性轉變后(從肉食性轉為植食性)，腸道中絲氨酸蛋白、酸性葡聚糖、興奮性氨基酸轉運蛋白3等參與消化代謝的基因也顯著增加。研究表明，青草類飼料對草魚體內環(huán)境的改善間接提高了魚體對飼料的利用率。在本研究中，草魚在攝食添加皇竹草粉的飼料后對生長表現(xiàn)出了正向的效果，盡管本研究中也發(fā)現(xiàn)草魚在攝食半精制飼料的過程中生長較為緩慢，針對皇竹草粉對草魚生長的影響還需后期長時間飼喂實驗或者在實用飼料中進行評估。

圖2 飼料中皇竹草粉對草魚幼魚肝臟生理生化指標的影響(n=3)

圖3 飼料中添加皇竹草粉后草魚幼魚腸道組織的顯微結構(×100)

MN：絨毛高度；MF：皺褶深度；MC：肌層厚度

MN: Villus height; MF: Folds depth; MC: Muscle thickness

表4 飼料中皇竹草粉對草魚幼魚腸道形態(tài)學影響(=3)

Tab.4 Effects of diets supplemented with P. sinese Roxb meal on intestinal morphology of juvenile grass carp (n=3)

圖4 飼料添加皇竹草粉對草魚腸道組織免疫基因相對表達的影響(n=3)

3.2 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚血清和肝臟生理生化指標的影響

魚類血液指標被廣泛運用于評價魚體健康狀況、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應狀況等，是一種良好的生理、病理和毒理學指標(周玉等, 2001)。AST和ALT在血液中的活性通常被用來指示肝臟的健康程度(郭小澤, 2013)。本研究中，攝食添加皇竹草粉飼料的草魚血清中的AST和ALT都顯著低于對照組，說明皇竹草粉減少了草魚肝細胞的損傷。類似的，草魚在攝食苦草()粉飼料后，血清中的AST活力也顯著降低(黃仲園等, 2020)，表明青草類飼料可能具有護肝的功效。這可能與肝臟脂肪含量有關，一般認為肝臟的脂肪含量和血清AST和ALT呈現(xiàn)正相關的關系(Tian, 2020)。本研究中，另外也檢測了肝臟的脂肪含量，發(fā)現(xiàn)攝食皇竹草粉后草魚肝臟的脂肪含量顯著降低，一些與肥胖相關的腸道菌群明顯下降(未發(fā)表資料)，推測皇竹草粉改善了腸道微環(huán)境，降低了草魚肝臟內脂肪的沉積，進而減少了肝細胞的損傷。與之對應的是，飼喂皇竹草粉后草魚肝臟的HOAD和COX活性顯著升高，這2種酶反映了細胞代謝的活力(Beenakkers, 1984; 曹玲芳等, 2013)，側面支持了皇竹草粉提高草魚肝臟健康的作用。

本研究中，飼喂皇竹草粉提高了草魚幼魚的成活率，間接表明皇竹草粉可能提高了魚體的抗病力。血液是機體免疫發(fā)生的主要內環(huán)境，作為補體激活經(jīng)典途徑的C4及補體激活替代途徑的C3主要成分在血液免疫功能上發(fā)揮著重要作用(唐宏剛, 2008)。本研究中，皇竹草粉組草魚C3和C4含量顯著增高，顯示飼料添加皇竹草粉一定程度增加草魚的抗病菌的能力。與徐奇友等(2010)在鯉魚()上的研究結果一致。一般認為，草粉飼料里富含多糖類物質，Chen等(2019)研究表明，飼料中添加多糖類飼料原料可以提高草魚稚魚血清中補體C3和C4含量，減少了細菌和病毒的感染。另一方面，抗氧化能力也是機體非特異免疫屏障中重要的一環(huán)，脂質，尤其是多不飽和脂肪酸易受氧自由基攻擊，引起膜脂質的氧化損傷，進而損害細胞的生物膜。MDA是脂質過氧化損傷的最終代謝產(chǎn)物，間接反映了細胞損傷的程度(Zhou, 2003)。本研究中，與C組相比較，P1組和P2組血清中MDA的含量都降低，表明飼料中添加皇竹草粉可能降低了魚體內部的氧化應激反應。在黃河鯉()中的研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿草(L.)粉也能夠降低MDA含量(王成章等, 2008)。草粉類物質中富含胡蘿卜素、硒和多種維生素(包括維生素C和維生素E)等，這些物質在提高機體抗氧化能力、消除自由基等方面均有積極的效果(史瑩華等, 2011)。氧化應激是很多應激損傷的本質所在，也是眾多病害發(fā)生的病理生理基礎(Lushchak, 2011)。本研究中，添加皇竹草粉后減緩的氧化應激可能是草魚生長增加和免疫性能提升的原因之一(Fast, 2008)。

3.3 飼料添加皇竹草粉對草魚幼魚腸道結構和基因表達的影響

腸道絨毛高度、皺褶深度、肌層厚度是衡量腸道消化、吸收和腸道健康的重要指標(張敏等, 2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加皇竹草粉提高了草魚幼魚腸道的絨毛高度和皺褶深度，但降低了肌層厚度。目前，較少的研究指出草粉在魚類腸道組織學的影響，但在肉雞()中發(fā)現(xiàn)，飼喂苜蓿草粉增加了腸絨毛的高度和肌層厚度(徐珊珊, 2013)。較長的絨毛能夠在腸腔中充分延伸，保證絨毛與食糜間的充分接觸，是提高消化吸收效率的結構保障(劉敏, 2009)。肌層厚度上升會造成魚類腸內膜面積變小，降低魚類對營養(yǎng)物質的消化吸收能力(姚浪群等, 2003)。推測腸絨毛高度的增加以及肌層厚度的降低是腸道對于更多營養(yǎng)物質吸收的適應性結果。另外，有益腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也在促進腸道發(fā)育過程中起到重要作用(余榮等, 2012)。本研究是采用等氮等能的飼料配方，在此機制下草魚在飼喂皇竹草粉后腸道對營養(yǎng)物質的吸收總量可能有所增強，有利于提高飼料的消化率，與本研究中飼料系數(shù)的變化趨勢相符。

除了消化和吸收營養(yǎng)素，腸道還扮演阻斷腸道內共生微生物屏障的作用(Patankar, 2020)。當腸道損傷、腸道微生物失衡或者病原菌入侵，均會造成腸道炎癥，造成機體的不健康狀態(tài)，增加死亡率。腫瘤壞死因子()是機體在病原體入侵時，由激活的巨噬細胞、淋巴細胞以及其他免疫細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，在抵抗細菌、病毒和寄生蟲感染的過程中發(fā)揮重要介質的作用(Horiuchi, 2010)。白細胞介素1β ()是一種由單核細胞、巨噬細胞、朗氏細胞等多種細胞產(chǎn)生的一種重要的促炎細胞因子，在炎癥過程中起著重要的作用(Bird, 2002)。魚類腸道中這2個細胞因子的表達量與腸炎密切相關(Liu, 2018; 胡鵬莉等, 2019)。本研究結果顯示，飼料中添加皇竹草粉下調了促炎細胞因子mRNA的相對表達水平，可能一定程度緩解腸道炎癥反應對組織的損害。在哺乳動物中，增加膳食纖維能夠緩解腸道炎癥，Singh等(2019)研究表明，纖維類食物主要通過改變腸道菌群的組成以及它們的代謝產(chǎn)物丁酸來調控腸道炎癥。此外，Zhou等(2020)研究指出，氣單胞菌屬()是一類條件致病菌，往往造成草魚的腸道炎癥。同時，Blumberg等(2012)研究指出，厚壁菌門(Firmicutes)細菌減少是腸道炎癥的主要表現(xiàn)之一。本研究還對攝食皇竹草粉飼料腸道菌群分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和氣單胞菌屬的豐度在皇竹草粉組顯著降低，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度顯著上調(未發(fā)表資料)，暗示皇竹草粉可能通過調節(jié)腸道菌群的組成，進而影響了腸道炎癥的狀態(tài)。

綜上所述，本研究探討了飼料添加皇竹草粉對草魚生長、免疫、抗氧化和腸道健康的影響。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加10%和20%的皇竹草粉能夠顯著促進草魚的生長、提高魚體非特異免疫力、降低氧化應激以及改善腸道炎癥狀況等。研究結果可為生產(chǎn)實踐中皇竹草作為一種新型的飼料原料的應用提供理論依據(jù)和基礎數(shù)據(jù)。

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Effects ofRoxb Meal on Growth, Antioxidant Response, and Intestinal Health of Juvenile Grass Carp ()

LI Yuping1,2, TIAN Jingjing2, ZHANG Kai2, XIA Yun2, WANG Guangjun2, YU Ermeng2, LI Zhifei2, GONG Wangbao2, XIE Jun2①

(1.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application and Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou, Guangdong 510380, China)

The purpose of this study was to evaluate the effects of dietaryRoxb meal on the growth, antioxidant response, and intestinal health of juvenile grass carp (). Three isonitrogenous and isoenergetic semi-purified diets containing 0% (control group C), 10%, and 20%Roxb meal (P1 and P2) were designed (protein level 36%, fat level 9%) and fed to juvenile grass carp (28.51±0.04) g for 8 weeks. The results showed that the weight gain rate and survival rate of fish in the P1 and P2 groups were significantly higher than those in the C group (<0.05). Serum malondialdehyde (MDA) levels in the P2 group were significantly lower than those in the C group (<0.05). The serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels of the P1 and P2 groups were significantly lower than those of the C group (<0.05). Fish in the P1 and P2 groups significantly increased their complement of C3 and C4 contents in the serum compared to those in the C group (<0.05). Meanwhile, these two groups also showed increased hepatic 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and cytochrome C oxidase activities (<0.05). The intestinal microstructure showed that the intestinal villus height and fold depth in the P1 and P2 groups were significantly increased compared with those in the C group, but the thickness of the muscle layer was reduced (<0.05). In terms of transcripts, the relative gene expression of intestinal pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha () and interleukin 1β () were significantly down-regulated in the P1 and P2 groups compared with those in the C group. In conclusion, our data showed that 10% and 20%Roxb meal dietary supplementation could enhance the growth, reduce the oxidative response, and improve the health status of the intestine in juvenile grass carp.

Grass carp;Roxb; Growth performance; Intestinal development; Enteritis

S963.7

A

2095-9869(2022)03-0045-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210326001

http://www.yykxjz.cn/

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XIE Jun, E-mail: xiejunhy01@126.com

* 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務費(2018SJ-YB02)、大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系專項(CARS-45-21)、廣東省自然科學基金(2018A030313412)和2019廣東省科技專項資金(2019B020204)共同資助 [This work was supported by the Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2018SJ-YB02), the Modern Agroindustry Technology Research System (CARS-45-21), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2018A030313412), and Science and Technology Special Fund of Guangdong Province (2019B020204)]. 李玉萍，E-mail: yupingli666@163.com

謝 駿，研究員，E-mail: xiejunhy01@126.com

2021-03-26,

2021-05-07

(編輯 陳 輝)